郜 娜， 楊慶宇, 劉秀梅

(1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部， 2鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000)

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利拉魯肽通過microRNA-33對(duì)2型糖尿病小鼠肝損傷的治療作用

郜 娜1△， 楊慶宇2, 劉秀梅2

(1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，2鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000)

目的： 觀察利拉魯肽對(duì)2型糖尿病小鼠肝組織微小RNA-33(microRNA-33,miR-33)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及肝細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白的影響，探討其可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)。方法： 采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射復(fù)制C57BL/6小鼠2型糖尿病模型。小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只：對(duì)照組為正常小鼠皮下注射等量的生理鹽水；模型組為T2DM小鼠皮下注射等量的生理鹽水；利拉魯肽低劑量組為T2DM小鼠皮下注射100 μg·kg-1·d-1利拉魯肽；利拉魯肽高劑量組為T2DM小鼠皮下注射200 μg·kg-1·d-1利拉魯肽。給藥4周后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，檢測各組小鼠空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的含量；HE染色檢測肝組織病理學(xué)變化；免疫熒光檢測肝組織的cleaved caspase-3；Western blot法檢測p-AMPK/AMPK及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、caspase-3的水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測肝組織miR-33的水平。結(jié)果： 與模型組相比，利拉魯肽高、低劑量組小鼠FBG、TG、TC、LDL-C、ALT及AST含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高(P<0.05)；肝組織病理結(jié)構(gòu)的紊亂得到明顯改善；免疫熒光結(jié)果可見，利拉魯肽高、低劑量給藥組小鼠的cleaved caspase-3明顯降低；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，利拉魯肽高、低劑量給藥組小鼠肝組織的Bcl-2表達(dá)明顯增高，caspase-3表達(dá)顯著下降(P<0.05)，肝組織AMPK磷酸化水平顯著增加(P<0.01)；且肝組織miR-33水平顯著降低(P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性。結(jié)論： 利拉魯肽可以緩解2型糖尿病小鼠肝損傷，其機(jī)制可能與降低肝組織miR-33表達(dá)，從而增加AMPK磷酸化水平，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

利拉魯肽; 微小RNA-33; 腺苷酸活化蛋白激酶; 肝細(xì)胞凋亡

糖尿病肝損傷是繼發(fā)于糖尿病，以肝功能損害為特點(diǎn)的慢性并發(fā)癥，表現(xiàn)為肝臟組織學(xué)和功能變化的改變。糖尿病導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，肝內(nèi)脂肪酸增多，脂肪在肝細(xì)胞中堆積形成脂肪肝，甚至演變?yōu)楦斡不M(jìn)而加重糖尿病肝損傷。近年來研究表明肝細(xì)胞凋亡是加速肝損傷的關(guān)鍵因素之一[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是廣泛分布于生物體內(nèi)的高度保守的蛋白激酶，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗增殖和抗凋亡等多種生物學(xué)作用，可從多途徑影響脂代謝，包括抑制脂肪酸與甘油三酯的合成，抑制膽固醇的合成以及促進(jìn)脂肪酸氧化分解等，且AMPK在抑制肝細(xì)胞凋亡方面具有很重要作用[2]。Jung 等[3]與Wu[4]等均報(bào)道，AMPK的激活可抑制肝細(xì)胞過度氧化應(yīng)激和改善線粒體功能。MicroRNA與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，參與調(diào)控三酰甘油和膽固醇的合成、脂肪酸的氧化與合成、相關(guān)酶的活性等[5-6]。并有報(bào)道微小RNA-33(microRNA-33,miR-33)能夠靶向沉默AMPK，控制甘油三酯的合成[7]。屈展[8]的研究亦表明，在人肝癌細(xì)胞(HepG2)中，miR-33可影響細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平，其可能機(jī)制為靶向結(jié)合AMPK沉默其表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的代謝。利拉魯肽(liraglutide，商品名Victoza，中文名“諾和力”)是長效人胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)類似物，其作為新型抗糖尿病藥物已被廣泛應(yīng)用。研究表明利拉魯肽除降糖，亦有多種作用，如可明顯降低糖尿病大鼠肝臟內(nèi)的脂質(zhì)含量，減輕糖尿病大鼠肝臟病變；可減少游離脂肪酸和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)C57BL/6小鼠模型上研究糖尿病肝損傷過程是否與miR-33-AMPK相關(guān)，且利拉魯肽是否通過調(diào)控miR-33改善糖尿病肝損傷。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)為SCXK(京)2011-0001。利拉魯肽購自諾和諾德制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20110026；血糖、總膽固醇(total choleste-rol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒生產(chǎn)于碧云天生物技術(shù)公司；I 抗GAPDH、AMPK、p-AMPK、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3及 II 抗購自CST；FITC熒光 II抗購自武漢奈德生命科技有限責(zé)任公司；Hoechst33342購自上海前生生物科技有限公司。低溫超速離心機(jī)(Thermo)；Western blot電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；熒光顯微鏡(OLYMPUS)；分析天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥 所有80只小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，溫度25 ℃，濕度55%～65%，維持12 h/12 h明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，其中65只高脂喂養(yǎng)4周后，腹腔注射100 mg/kg鏈脲菌素(streptozocin，STZ)復(fù)制T2DM小鼠模型，4周后檢測空腹血糖，選取血糖在7.8～15 mmol/L的45只小鼠納入實(shí)驗(yàn)并隨機(jī)分為3組，即模型組：T2DM小鼠皮下注射等量的生理鹽水；利拉魯肽低劑量組：T2DM小鼠皮下注射100 μg·kg-1·d-1利拉魯肽；利拉魯肽高劑量組：T2DM小鼠皮下注射200 μg·kg-1·d-1利拉魯肽。其余15只正常小鼠作為對(duì)照組，皮下注射等量的生理鹽水。給藥4周后，摘眼球取血，3 500 r/min離心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。分離肝臟，一部分保存于-80 ℃冰箱，一部分固定于10%的甲醛溶液中待用。

2.2 生化指標(biāo)的測定 小鼠禁食12 h后，眼眶靜脈叢取血，檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT 及AST含量。

2.3 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT) 給藥4周后進(jìn)行OGTT，所有小鼠禁食過夜后，給予40%葡萄糖(2 g/kg)處理，分別于0 min、30 min、60 min、90 min和120 min眼眶靜脈叢采取血樣，3 500 r/min離心15 min，吸取上清用于測定血糖。

2.4 HE染色 將固定于10%甲醛溶液中的肝組織脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，伊紅染色，蘇木精復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片，光鏡下觀察，進(jìn)行病理學(xué)分析。

2.5 免疫熒光檢測肝組織的cleaved caspase-3 將固定于10%甲醛中的肝組織脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片。切片如下處理：二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，PBS洗5 min 3次，5%～10%山羊血清室溫孵育30 min，0.3% Triton X打孔， I 抗cleaved caspase-3(1∶100)孵育過夜，PBS洗5 min 3次，熒光II抗(1∶200)室溫避光孵育120 min，PBS洗5 min 3次，Hoechst 33342室溫避光染色120 min，PBS洗5 min 3次，封片，顯微鏡下觀察。

2.6 Western blot法檢測AMPK及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 提取肝組織蛋白，測定樣品蛋白含量并稀釋樣本，配制5%濃縮膠、12%和15%分離膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，于5% BSA或 5%脫脂奶粉封閉液于室溫封閉2 h，TBST洗膜5 min 3次，加入I抗[AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)]，4 ℃冰箱過夜孵育，TBST洗膜5 min 3次，II 抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min 3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Quantity One軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.7 Real-time PCR檢測肝組織中miR-33水平 采用TRIzol兩步法抽提小鼠肝組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min； 85 ℃ 5 min。所得cDNA于-20 ℃中保存待用。

采用real-time PCR 檢測小鼠肝組織中 miR-33含量，以U6作為內(nèi)參照。miR-33的上游引物為5′-GCCGTGCATTGTAGTTGC-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6的下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTGCG-3′,上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 15 s。miR-33含量按公式2-ΔΔCt計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為方差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠血清生化指標(biāo)的變化

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖水平顯著升高(P<0.01)，脂質(zhì)代謝嚴(yán)重紊亂即血清中TC、TG、LDL-C、ALT及AST含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，利拉魯肽高、低劑量組小鼠空腹血糖明顯降低(P<0.05)，脂質(zhì)代謝紊亂得到一定改善，即血清中TC、TG、LDL-C、ALT及AST含量明顯降低(P<0.05)，HDL-C含量明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性,見表1。

表1 各組小鼠血清生化指標(biāo)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

2 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組、模型組以及利拉魯肽高、低劑量組小鼠血糖均在給予葡萄糖30 min后達(dá)到峰值，隨后下降。與對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖在各時(shí)點(diǎn)處在高水平狀態(tài)；與模型組比較，利拉魯肽高、低劑量組小鼠血糖水平有顯著下降，且呈劑量依賴性。曲線下面積計(jì)算結(jié)果亦顯示模型組明顯高于對(duì)照組，而給藥組明顯低于模型組(P<0.05),見圖1。

3 利拉魯肽對(duì)糖尿病小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索、肝竇排列規(guī)則，且肝小葉分界明顯，肝細(xì)胞胞質(zhì)均勻，無顆粒、脂肪、纖維變性等；而模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索、肝竇排列不規(guī)則，肝細(xì)胞腫大、輕度變形；給藥組小鼠肝組織趨于正常，肝細(xì)胞索、肝竇排列較規(guī)則，且高劑量組治療作用優(yōu)于低劑量組,見圖2。

Figure 1.Curves of blood glucose concentration versus time (A) and area under the curve (AUC; B) in oral glucose tolerance test (OGTT). Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

圖1 OGTT曲線及OGTT曲線下面積

Figure 2.Histological examination of liver in each group (HE staining, ×200). A: control; B: model; C: liraglutide (100 μg/kg); D: liraglutide (200 μg/kg).

圖2 各組小鼠肝臟病理學(xué)檢查

4 免疫熒光檢測肝組織cleaved caspase-3的變化

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，cleaved caspase-3明顯增加；與模型組比較，利拉魯肽高、低劑量組小鼠肝組織綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，cleaved caspase-3明顯降低，且呈劑量依賴性,見圖3。

5 利拉魯肽對(duì)肝組織AMPK及凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠AMPK磷酸化水平顯著降低，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3剪切水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；與模型組相比，利拉魯肽高、低劑量組小鼠肝組織AMPK磷酸化水平明顯升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)明顯升高，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3剪切水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性,見圖4。

6 利拉魯肽對(duì)肝組織miR-33表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中的miR-33含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，利拉魯肽高、低劑量組小鼠肝組織中的miR-33含量明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性,見圖5。

討 論

繼心血管疾病和惡性腫瘤之后，糖尿病作為第三大嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升。糖尿病性肝損傷是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，但由于肝臟巨大的代償功能，其臨床表現(xiàn)隱匿，容易被忽視[10]。因此，明確糖尿病肝損傷的發(fā)病機(jī)制以及尋求有效的藥物治療具有非常重要的意義。

Figure 3.Expression of cleaved caspase-3 in liver detected by immunofluorescence. A: control; B: model; C: liraglutide (100 μg/kg); D: liraglutide (200 μg/kg).

圖3 免疫熒光檢測肝組織的cleaved caspase-3

Figure 4.Expression of AMPK, Bcl-2 and caspase-3 in liver of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

圖4 各組小鼠肝組織中AMPK及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

越來越多的研究表明胰島素抵抗可能是糖尿病肝損傷的啟動(dòng)因素，外周胰島素抵抗導(dǎo)致脂肪組織的脂解作用增強(qiáng)，肝臟內(nèi)三酰甘油及游離脂肪酸的含量增加，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并引起肝細(xì)胞的凋亡。進(jìn)而，肝損傷又加重胰島素抵抗，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、肝細(xì)胞炎癥壞死及纖維化等[11-12]。AMPK是廣泛分布于生物體內(nèi)的高度保守的蛋白激酶，具有多種生物學(xué)作用，參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生過程，在控制機(jī)體代謝平衡方面發(fā)揮重要作用。AMPK可從多種途徑影響脂質(zhì)代謝，包括抑制脂肪酸和甘油三酯的合成，抑制膽固醇的合成以及促進(jìn)脂肪酸氧化分解等。此外，AMPK在抑制肝細(xì)胞凋亡方面具有很重要作用。

Figure 5.Expression of miR-33 in liver of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

圖5 各組小鼠肝組織miR-33含量的變化

利拉魯肽是長效人GLP-1的類似物，其作為新型抗糖尿病藥物已廣泛應(yīng)用于臨床。研究表明利拉魯肽具有降血糖以外的多種作用，利拉魯肽顯著減少糖尿病大鼠肝臟內(nèi)的脂質(zhì)含量，減輕糖尿病大鼠肝臟病變；減少細(xì)胞因子和游離脂肪酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。

本文主要探討利拉魯肽通過調(diào)節(jié)miR-33-AMPK抑制肝細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。利拉魯肽能夠明顯改善糖尿病小鼠肝臟病理變化，與模型組比較，HE染色結(jié)果顯示利拉魯肽組小鼠組織趨于正常，肝臟肝細(xì)胞索、肝竇排列較規(guī)則。利拉魯肽能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖血脂水平及脂質(zhì)堆積，血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示利拉魯肽組FBS、TG、TC、LDL-C、ALT及AST含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高。免疫熒光結(jié)果顯示肝組織cleaved caspase-3明顯降低，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bcl-2表達(dá)明顯降低，caspase-3表達(dá)水平明顯增加，其機(jī)制可能與利拉魯肽通過降低肝組織miR-33水平，進(jìn)而抑制AMPK磷酸化有關(guān)。

綜上所述，糖尿病小鼠肝組織的miR-33含量增加，抑制AMPK磷酸化水平，加速肝細(xì)胞凋亡；利拉魯肽可顯著降低肝組織中miR-33的含量，進(jìn)而使AMPK活化程度增加，抑制肝細(xì)胞凋亡。

[1] Jou J, Choi SS, Diehl AM. Mechanisms of disease progression in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Semin Liver Dis, 2008, 28(4):370-379.

[2] Viollet B, Guigas B, Leclerc J, et al. AMP-activated protein kinase in the regulation of hepatic energy metabolism: from physiology to therapeutic perspectives[J]. Acta Physiol (Oxf), 2009, 196(1):81-98.

[3] Jung EH, Lee JH, Kim SC, et al. AMPK activation by liquiritigenin inhibited oxidative hepatic injury and mitochondrial dysfunction induced by nutrition deprivation as mediated with induction of farnesoid X receptor[J]. Eur J Nutr, 2015, Dec 8. [Epub ahead of print]

[4] Wu SB, Wu YT, Wu TP, et al. Role of AMPK-mediated adaptive responses in human cells with mitochondrial dysfunction to oxidative stress[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(4):1331-1344.

[5] Moore KJ, Rayner KJ, Suárez Y, et al. The role of microRNAs in cholesterol efflux and hepatic lipid metabolism[J]. Annu Rev Nutr, 2011, 31:49-63.

[6] Fernández-Hernando C, Suárez Y, Rayner KJ, et al. MicroRNAs in lipid metabolism[J]. Curr Opin Lipidol, 2011, 22(2):86-92.

[7] Rottiers V, Najafi-Shoushtari SH, Kristo F, et al. MicroRNAs in metabolism and metabolic diseases[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2011, 76:225-233.

[8] 屈 展. 二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖及凋亡的影響及其機(jī)制研究[D]. 長沙: 中南大學(xué), 2012.

[9] Samson SL, Bajaj M. Potential of incretin-based therapies for non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Diabetes Complications, 2013, 27(4):401-406.

[10]Wlazlo N, Beijers HJ, Schoon EJ, et al. High prevalence of diabetes mellitus in patients with liver cirrhosis[J]. Diabet Med, 2010, 27(11):1308-1311.

[11]Bianchi G, Bugianesi E, Frystyk J, et al. Adiponectin isoforms, insulin resistance and liver histology in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Dig Liver Dis, 2011, 43(1):73-77.

[12]Sanyal AJ, Campbell-Sargent C, Mirshahi F, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: association of insulin resistance and mitochondrial abnormalities[J]. Gastroenterology, 2001, 120(5):1183-1192.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Liraglutide ameliorates liver injury of type 2 diabetic mice via micro-RNA-33-AMPK pathway

GAO Na1, YANG Qing-yu2, LIU Xiu-mei2

(1DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,2DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China.E-mail:gn_submit@163.com)

AIM: To observe the effects of liraglutide on the level of microRNA-33 (miR-33) and the expression of AMP-activated protein kinase (AMPK) and apoptosis-related proteins in mice with type 2 diabetes mellitus (T2DM), and to explore its possible mechanism. METHODS: High-fat diet and intraperitoneal injection of streptozocin were used to establish the type 2 diabetic model in C57BL/6 mice. The mice were randomly divided into 4 groups (n=15): in control group, the normal mice were subcutaneously injected with equivalent volume of saline; in model group, the T2DM mice were subcutaneously injected with equivalent volume of saline; in low- and high-dose liraglutide treatment groups, the T2DM mice were subcutaneously injected with 100 and 200 μg·kg-1·d-1, respectively. After 4 weeks of administration, the levels of FBG, TG, TC, HDL-C, LDL-C, ALT and AST were determined. HE staining was used to observe the pathological changes of the liver tissues. The protein level of cleaved caspase-3 in the liver tissue was detected by the technique of immunofluorescence. The protein levels of p-AMPK/AMPK and apoptosis-related proteins were detected by Western blot. The expression of miR-33 in the liver tissues was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with model group, the contents of FBG, TG, TC, LDL-C, ALT and AST were decreased significantly, while the content of HDL-C was increased significantly in low-dose liraglutide group and high-dose liraglutide group (P<0.05). The protein levels of phosphorylated AMPK and Bcl-2 were up-regulated significantly, and the expression of cleaved caspase-3 was down-regulated significantly (P<0.05). The level of miR-33 was decreased significantly (P<0.01). CONCLUSION: Liraglutide alleviates liver injury in type 2 diabetic mice, and the mechanism may be associated with reducing the level of miR-33 and increasing the phosphorylation of AMPK in the liver tissues, thereby inhibiting hepatocyte apoptosis.

Liraglutide; MicroRNA-33; AMP-activated protein kinase; Hepatocyte apoptosis

1000- 4718(2017)01- 0086- 06

2016- 04- 05

2016- 07- 13

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.014

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△通訊作者 Tel: 0371-65587016; E-mail: gn_submit@163.com