孫淼淼，姜國(guó)忠，趙志華，劉 凱，陳奎生

(1.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

晚期糖化終產(chǎn)物受體在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其意義

孫淼淼1，姜國(guó)忠2，趙志華2，劉 凱2，陳奎生2

(1.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科、河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

目的 探討食管鱗癌組織中晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組化S-P法對(duì)50例食管鱗癌組織、30例癌旁不典型增生組織以及50例正常食管黏膜組織中RAGE蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；運(yùn)用原位雜交方法對(duì)50例食管鱗癌組織、30例癌旁不典型增生組織以及50例正常食管黏膜組織中RAGE mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 食管鱗癌組織中RAGE蛋白、mRNA陽性表達(dá)率明顯高于癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織，三者兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；食管鱗癌組織中RAGE蛋白、mRNA陽性表達(dá)率與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 RAGE高表達(dá)可能與食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

食管鱗癌；晚期糖化終產(chǎn)物受體；免疫組化；原位雜交

食管癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生機(jī)制至今尚不十分清楚。晚期糖化終產(chǎn)物受體(receptors for adanced gIycation end products，RAGE)是一種表達(dá)于多種細(xì)胞表面的生物分子，初期研究表明RAGE及其配體的結(jié)合與糖尿病并發(fā)的腎病以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，近期研究發(fā)現(xiàn)RAGE在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用[1-2]，有關(guān)RAGE與食管癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組化及原位雜交方法對(duì)食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織以及正常食管黏膜組織中RAGE蛋白、mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討RAGE在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 50例食管鱗癌組織、30例癌旁不典型增生組織以及50例正常食管黏膜組織標(biāo)本取自2013年1月至12月期間河南省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本。所取標(biāo)本均經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，備用。50例食管鱗癌患者中，男26例，女24例；年齡34～79歲，中位年齡61歲，年齡≥60歲者30例，<60歲者20例；浸潤(rùn)至黏膜下層或淺肌層者10例，浸潤(rùn)至深肌層者12例，浸潤(rùn)至全層或外膜者28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。所有被選擇的患者術(shù)前均未接受過放療、化療及其他相關(guān)治療。

1.2 主要試劑 RAGE單克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；RAGE探針由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；S-P免疫組化通用試劑盒、SA-AP顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化主要步驟 嚴(yán)格依照免疫組化S-P法試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用已知RAGE陽性表達(dá)的鼻咽鱗癌組織作為陽性對(duì)照，應(yīng)用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 原位雜交主要步驟 組織經(jīng)新鮮配制二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水后,用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶消化標(biāo)本DNA結(jié)合蛋白；滴加不含探針的預(yù)雜交液(42 ℃),預(yù)雜交4 h；滴加含探針的雜交液，42 ℃濕盒內(nèi)雜交12 h；滴加SA-AP 37 ℃，30 min，BCIP/NBT,避光顯色2～4 h。用已知RAGE mRNA陽性表達(dá)的鼻咽鱗癌組織作為陽性對(duì)照；用不含探針的預(yù)雜交液孵育標(biāo)本作為陰性對(duì)照。

1.5 免疫組化及原位雜交結(jié)果判斷 依據(jù)參考文獻(xiàn)[3]，應(yīng)用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，每張切片觀察10個(gè)視野(×200)，并取平均值。按陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比分為：陰性(-)，陽性細(xì)胞≤5%；弱陽性(+)，陽性細(xì)胞占>5%～25%；陽性(++)，陽性細(xì)胞占>25%～50%；強(qiáng)陽性(+++)，陽性細(xì)胞>50%。為便于統(tǒng)計(jì)，將弱陽性(+)和陰性(-)歸為陰性，陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)歸為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率的比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RAGE蛋白在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織以及正常食管黏膜組織中的表達(dá) RAGE蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色顆粒，RAGE在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織以及正常食管黏膜組織中的蛋白陽性表達(dá)率分別為80.0%(40/50)、63.3%(19/30)和30.0%(15/50)，組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.23，P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 RAGE 蛋白在食管鱗癌組織(A)、癌旁不典型增生組織(B)以及正常食管黏膜組織(C)中的表達(dá) 表1 RAGE蛋白在食管鱗癌組織、 癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織中的表達(dá)

組別n陽性陰性陽性率/%χ2P食管鱗癌組織50401080．0癌旁不典型增生組織30191163．37．230．034正常食管黏膜組織50153530．0

2.2 RAGE蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 RAGE蛋白的陽性率與食管鱗癌腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的年齡、性別無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

2.3 RAGE mRNA在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織以及正常食管黏膜組織中的表達(dá) RAGE mRNA陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為藍(lán)紫色顆粒，RAGE在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜組織中的mRNA陽性表達(dá)率分別為84.0%(42/50)、60.0% (18/30)和26.0%(13/50)，組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.10，P<0.05)。見圖2、表3。

表2 食管鱗癌組織中RAGE蛋白的表達(dá)與患者的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

臨床病理指標(biāo)nRAGE蛋白表達(dá)陽性陰性陽性表達(dá)率/%χ2P性別 男2621580．80．1090．379 女2419579．2年齡/歲 ≥603024680．00．0120．912 <602016480．0浸潤(rùn)深度 淺肌層104640．0 深肌層128466．71．8760．042 全層28280100．0淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2524196．01．6500．039 無2516964．0

圖2 RAGE mRNA在食管鱗癌組織(A)、癌旁不典型增生組織(B)以及正常食管黏膜組織(C)中的表達(dá)

2.4 食管鱗癌組織中RAGE mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系RAGE mRNA的陽性表達(dá)率與食管鱗癌腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、性別無關(guān)(P均>0.05)。見表4。

3 討論

RAGE是免疫球蛋白超家族的新成員之一。研究[4]發(fā)現(xiàn)RAGE表達(dá)于正常肺組織中，但在炎性組織

中其表達(dá)上升。在缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)的情況下，RAGE信號(hào)途徑的持續(xù)活化，導(dǎo)致細(xì)胞自溶增強(qiáng)、凋亡和減少壞死，進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生[5]。

表3 RAGE mRNA在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織以及正常食管黏膜組織中的表達(dá)

組別n陽性陰性陽性率/%χ2P食管鱗癌組織5042884．0癌旁不典型增生組織30181260．08．100．032正常食管黏膜組織50133726．0

表4 食管鱗癌組織中RAGEmRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

臨床病理指標(biāo)nRAGEmRNA表達(dá)陽性陰性陽性率/%χ2P性別 男2622484．60．0210．086 女2420483．3年齡/歲 ≥603025583．30．0310．090 <602017385．0浸潤(rùn)深度 淺肌層105550．0 深肌層129375．03．2580．031 全層28280100．0淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2524196．03．0410．035 無2518772．0

研究[6]表明RAGE表達(dá)水平顯著增高不但與炎癥相關(guān)病理狀態(tài)有關(guān)，而且其高表達(dá)還與包括結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)參與了胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌及前列腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，還有研究[7]報(bào)道RAGE表達(dá)水平的增高與腫瘤組織的分化、瘤體大小等有關(guān)。

有關(guān)RAGE表達(dá)與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究至今尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組化S-P法檢測(cè)了50例食管鱗癌組織、30例癌旁不典型增生組織以及50例正常食管黏膜組織中RAGE蛋白表達(dá)；運(yùn)用原位雜交方法檢測(cè)了50例食管鱗癌組織、30例癌旁不典型增生組織以及50例正常食管黏膜組織中RAGE mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中RAGE蛋白、mRNA陽性表達(dá)率明顯高于癌旁不典型增生組織以及正常食管黏膜組織，三者兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RAGE蛋白、mRNA陽性表達(dá)率與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。本研究結(jié)果提示，RAGE高表達(dá)可能與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

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作者簡(jiǎn)介：王宏琴(1971-)，女，主管藥師，主要從事腫瘤藥學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：18537333189@163.com

Expression and Signficance of Receptors for Adanced Giycation End Products in the Esophageal Squamous Carcinoma Tissues

Sun Miaomiao1，Jiang Guozhong2，Zhao Zhihua2，Liu Kai2，Chen Kuisheng2

(1.DepartmentofPathology，HenanTumorHospital，Zhengzhou450003China;2.DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of receptors for adanced gIycation end products (RAGE) in the esophageal squamous cell carcinoma tissues.Methods The expressions of RAGE protein in 50 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues，30 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 50 cases of normal esophageal mucosa tissues were detected by immunohistochemistry; the expressions of RAGE mRNA in 50 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissues，30 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 50 cases of normal esophageal mucosa tissues were detected by in situ hybridization.Results The positive expression rates of RAGE protein and mRNA in the esophageal squamous carcinoma tissues were significantly higher than those of the atypical hyperplasia tissue adjacent to carcinoma and the normal esophageal mucosa (P<0.05).RAGE protein and mRNA positive expressions were associated with tumor infiltration depth，lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion The high positive expression rates of RAGE may be related to the occurrence and development of esophageal squamous carcinoma.

esophageal squamous carcinoma; receptors for adanced gIycation end products; immunohistochemistry; in situ hybridization

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：122300410073)

孫淼淼(1979-)，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤病理工作。E-mail：sunmiaomiaohd@163.com

陳奎生(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理工作。E-mail：chenksh2002@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.06.003

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2016)06-0467-04

2016-09-13)