張成娟，魏 冰，馬 杰

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院分子病理科，河南 鄭州 450008)

膠質(zhì)瘤中異檸檬酸脫氫酶的檢測(cè)及其臨床意義

張成娟，魏 冰，馬 杰

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院分子病理科，河南 鄭州 450008)

目的 分析異檸檬酸脫氫酶(IDH)在膠質(zhì)瘤中的突變情況，探討IDH基因突變對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后意義。方法 通過Sanger DNA測(cè)序法檢測(cè)膠質(zhì)瘤中IDH基因突變情況，同時(shí)比較分析IDH突變?cè)诓煌巳褐械耐蛔冾l率以及對(duì)預(yù)后的影響。結(jié)果 20例膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)IDH突變7例，均為IDH1 R132H(C.395G>A)突變，突變率為35.0%；存在IDH突變的膠質(zhì)瘤患者無進(jìn)展生存期和總生存期優(yōu)于IDH野生型患者。結(jié)論 IDH突變對(duì)膠質(zhì)瘤的輔助診斷和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。

膠質(zhì)瘤；異檸檬酸脫氫酶；基因突變

1 膠質(zhì)瘤的診治現(xiàn)狀

膠質(zhì)瘤是指起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類將膠質(zhì)瘤分為WHO Ⅰ～Ⅳ級(jí)，Ⅰ、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤[1]。膠質(zhì)瘤約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%，在兒童惡性腫瘤中居第2位，近30 a來，原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)生率逐年遞增，年增長(zhǎng)率約為1.2%，中老年人群尤為明顯。其中在原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM,WHO Ⅳ級(jí))的發(fā)病率最高，占46.1%，且男性多于女性,其次是彌漫性星形細(xì)胞瘤，發(fā)病率為0.53/10萬。

目前，替莫唑胺同步放療聯(lián)合輔助化療已成為新診斷GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但是，膠質(zhì)瘤的整體治療效果欠佳。膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織界限不清，僅靠手術(shù)難以治愈，應(yīng)結(jié)合放療和化療等綜合治療以延緩腫瘤復(fù)發(fā)，盡可能延長(zhǎng)患者無進(jìn)展生存期和總生存期，提高生活質(zhì)量。但是由于血腦屏障等因素的影響，化療藥物和一般抗腫瘤的中藥治療效果也不理想，因此腦膠質(zhì)瘤至今仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一。其中，成人高級(jí)別膠質(zhì)瘤的1 a及5 a的總生存期分別為30%和13%[1]。在目前精準(zhǔn)醫(yī)療的大背景下以及分子病理等新興學(xué)科的推動(dòng)下，如何發(fā)現(xiàn)有效的膠質(zhì)瘤診治分子靶點(diǎn)就顯得尤為重要，相關(guān)分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)將對(duì)膠質(zhì)瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)以及對(duì)化療藥物的反應(yīng)性等具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 膠質(zhì)瘤中IDH基因突變的檢測(cè)

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是由IDH基因編碼的蛋白酶，是一類在三羧酸循環(huán)中起重要作用的酶家族。IDH蛋白酶通過氧化脫羧作用催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，脫下的氫進(jìn)一步由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP+)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)接受生成NAD(P)H+H+。人類和其他真核生物既有NADP+依賴的IDH(IDH1和IDH2)又有NAD+依賴的IDH(IDH3)[2]。本研究中膠質(zhì)瘤IDH基因突變的檢測(cè)我們采用腫瘤相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑盒IDH1-IDH2(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)。

2.1 樣本處理 石蠟切片組織，去除表面3～5張，取手術(shù)大標(biāo)本(2～3張)，內(nèi)鏡、穿刺小標(biāo)本(5～10張)，厚度3～5 μm，置于1.5 mL EP管中。用二甲苯及無水乙醇進(jìn)行常規(guī)脫蠟并于100 ℃金屬浴中烘干，然后加入200 μL Buffer GA，20 μL Proteinase K充分混勻，置于56 ℃水浴消化過夜，依次按步驟用石蠟樣本提取試劑提取腫瘤DNA(北京天根生化科技有限公司)。2.2 PCR擴(kuò)增 各反應(yīng)體系配制：PCR反應(yīng)液9.5 μL + MIX3 12.5 μL。從陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、樣本DNA液中分別取3 μL，加入PCR預(yù)混液中，快速離心10 s，將其移至檢測(cè)區(qū)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，PCR擴(kuò)增條件見表1。PCR產(chǎn)物需經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，如果各反應(yīng)液的PCR產(chǎn)物條帶清晰單一(IDH1-127-132反應(yīng)液的擴(kuò)增片段大小在260 bp，IDH2-140反應(yīng)液的擴(kuò)增片段大小在274 bp，IDH2-172反應(yīng)液的擴(kuò)增片段大小在194 bp)，則認(rèn)為該P(yáng)CR產(chǎn)物擴(kuò)增良好，可進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增條件

保溫40次循環(huán)保溫42℃，5min94℃，30s72℃，5min94℃，5min58℃，30s——72℃，1min—

2.3 PCR產(chǎn)物的酶解 對(duì)陽性標(biāo)本，其PCR產(chǎn)物取5 μL，再加入2 μL SAP MIX，混勻。37 ℃ 60 min，80 ℃ 15 min，最后4 ℃保存。

2.4 測(cè)序PCR反應(yīng) 選取陽性PCR酶解產(chǎn)物3 μL、測(cè)序試劑(bigdye)1 μL和測(cè)序引物2 μL。具體條件見表2。

表2 PCR反應(yīng)條件

變性30次循環(huán)恒溫96℃，1min96℃，10s4℃—50℃，5s——60℃，4min—

2.5 測(cè)序產(chǎn)物的純化及分析 用乙醇常規(guī)純化測(cè)序產(chǎn)物，ABI 3130上機(jī)測(cè)序，然后使用測(cè)序分析軟件Chromas對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.6 結(jié)果 本研究共檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者20例，發(fā)現(xiàn)IDH1突變7例，均為IDH1 R132H(C.395G>A)突變，突變率為35.0%。見圖1～4。

3 IDH基因突變?cè)谀X膠質(zhì)瘤中的臨床意義

人類IDH基因突變最早發(fā)現(xiàn)于成人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中[3]，后續(xù)有研究報(bào)道IDH1的突變也可存在于前列腺癌、大腸癌、肺癌、副神經(jīng)節(jié)瘤，急性髓細(xì)胞性白血病等不同類型的腫瘤中[4]。近年來，隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，腦膠質(zhì)瘤分子病理學(xué)方面的研究取得了突破性進(jìn)展，目前發(fā)現(xiàn)的IDH突變大多數(shù)位于酶催化活性中心的保守區(qū)域，且均為雜合型突變，最常見的突變位點(diǎn)是IDH1 R132和IDH2 R172，其中精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R132H)是IDH1最常見的類型，約占80%～90%。

2009年，Yan等[5]就發(fā)現(xiàn)IDH基因突變廣泛存在于腦膠質(zhì)瘤患者中，且IDH突變患者的預(yù)后明顯優(yōu)于IDH野生型患者。在2015年6月，Jeanette等[6]的研究表明在Ⅱ和Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中，IDH基因突變與患者總體生存期獨(dú)立相關(guān)，且IDH突變患者的總生存期明顯優(yōu)于IDH野生型患者，IDH和端立酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse trarscriptase,TERT)同時(shí)突變的患者總生存期最長(zhǎng)，同時(shí)TERT、IDH和1p19q陰性組的患者總體生存期比TERT和IDH雙重突變組或三重陽性組均明顯短。Yang等[7]觀察了274例膠質(zhì)瘤患者基因突變與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)根據(jù)IDH和TERT的突變狀態(tài)，將膠質(zhì)瘤分為4個(gè)分子病理學(xué)亞型，其預(yù)后明顯不同：IDH突變/TERT突變預(yù)后最好，其次為IDH突發(fā)/TERT野生，IDH野生/TERT野生預(yù)后較差，而IDH野生/TERT突變預(yù)后最差。同時(shí)，Zhang等[8]也發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中IDH基因狀態(tài)不同，患者對(duì)放、化療的敏感性也存在差異，研究結(jié)果表明在IDH突變組中術(shù)后接受放、化療患者的疾病無進(jìn)展生存期比未接受放、化療患者明顯延長(zhǎng)(P<0.001)，而在IDH野生型組中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

圖1 IDH1序列(R132)

圖2 IDH1突變序列(R132H)

圖3 IDH2序列(R140)

圖4 IDH2序列(R172)

IDH突變是膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中重要的基因突變事件，但是具體如何導(dǎo)致腫瘤變化尚不清楚[9-11]。目前，F(xiàn)lavahan等[12]研究表明，IDH突變型膠質(zhì)瘤在粘連蛋白與CCCTC結(jié)合因子的結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)超甲基化，處于中間的位點(diǎn)高度甲基化能導(dǎo)致不同尋常的三維染色體構(gòu)象改變，由此突變的IDH干擾染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，促進(jìn)促癌基因表達(dá)。同時(shí)IDH蛋白能影響腫瘤代謝，產(chǎn)生2-羥基戊二酸依賴羥化酶，包括5-甲基胞嘧啶羥化酶的TET家族。但由于TET酶的下游受影響的基因較多，具體如何導(dǎo)致腫瘤的變化目前尚不清楚。

4 結(jié)語

最近10 a來，伴隨人類基因圖譜的繪制完成、基因突變和疾病關(guān)系認(rèn)識(shí)的深化，精準(zhǔn)醫(yī)療正向人們走來。精準(zhǔn)醫(yī)療是在預(yù)防、診斷和治療疾病過程中根據(jù)個(gè)體差異提供個(gè)性化醫(yī)療服務(wù)。精準(zhǔn)醫(yī)療通過對(duì)腫瘤發(fā)生分子基礎(chǔ)的研究對(duì)疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷分子分型和治療方案的設(shè)計(jì)產(chǎn)生重大影響，以達(dá)到降低疾病風(fēng)險(xiǎn)和更有效治療疾病，提高人類健康水平的目的。相比較傳統(tǒng)的形態(tài)病理學(xué)，分子病理學(xué)技術(shù)能夠提供更全面、更客觀的依據(jù)，從而更好指導(dǎo)腫瘤的靶向治療和預(yù)后評(píng)估。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是醫(yī)學(xué)科技發(fā)展的必然，分子病理學(xué)也必將在未來的醫(yī)療領(lǐng)域里扮演越來越重要的角色。IDH基因的檢測(cè)將為膠質(zhì)瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供重要的依據(jù)，IDH突變是低級(jí)別膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)瘤的重要標(biāo)志物，IDH突變對(duì)輔助治療敏感性具有良好的預(yù)測(cè)作用，根據(jù)IDH、TERT突變劃分的膠質(zhì)瘤分子病理學(xué)分型對(duì)評(píng)估患者預(yù)后具有極其重要的意義。

[1] 《中國(guó)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷和治療指南》編寫組. 中國(guó)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2016，96(7)：485-509.

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Detection of Isocritrate Dehydrogenase and Its Clinical Significance in the Gliomas

Zhang Chengjuan,Wei Bing,Ma Jie

(DepartmentofMolecularPathology,HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China)

Objective To analyze the mutations of isocitrate dehydrogenase (IDH) in the gliomas,and to explore the diagnostic and prognostic significance of IDH gene mutations in gliomas.Methods DNA Sanger sequencing method was used to detect the mutation of IDH gene,and the mutation frequency of IDH gene and the effect of mutation on the prognosis in different populations were compared.Results IDH mutations were found in 7 cases with 20 cases of glioma,which were IDH1 R132H (C.395G > A) mutation,and the mutation rate was 35.0%; the progression free survival and overall survival were longer in the patients who had the IDH mutation than the patients who had the wild type of IDH gene.Conclusion IDH mutation has an important clinical significance in the diagnosis and prognosis of gliomas.

glioma; isocitrate dehydrogenase; gene mutation

國(guó)家自然科學(xué)基礎(chǔ)青年基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81602637)；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201303192)

張成娟(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療相關(guān)基因檢測(cè)及其臨床應(yīng)用的研究工作。E-mail:zcj2016@126.com

馬杰(1963-)，男，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理診斷及分子分型研究工作。E-mail:majie@memail.com.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.06.001

R735.3；R730.53

A

1673-5412(2016)06-0461-04

2016-08-10)