全 杰，邱德來，初春平，邴艷華，金文哲

(延邊大學(xué)1.附屬醫(yī)院疼痛科、2.醫(yī)學(xué)部細(xì)胞功能研究中心，生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133000)

◇研究簡報◇

依托咪酯對小鼠小腦皮層浦肯野細(xì)胞自發(fā)放電活動的影響

全 杰1，邱德來2，初春平2，邴艷華2，金文哲1

(延邊大學(xué)1.附屬醫(yī)院疼痛科、2.醫(yī)學(xué)部細(xì)胞功能研究中心，生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133000)

依托咪酯(etomidate，ET)是一種作用強(qiáng)、短效的非巴比妥類靜脈麻醉藥，常用于麻醉誘導(dǎo)和門診手術(shù)麻醉。研究表明，ET可直接或間接作用于丘腦皮層神經(jīng)元GABAA受體，產(chǎn)生GABA樣的作用，或增強(qiáng)GABA與GABAA受體結(jié)合所引起的效應(yīng)，減少神經(jīng)元動作電位的發(fā)生頻率[1]。ET明顯抑制初級感覺皮層錐體細(xì)胞電壓門控Na+通道，減小Na+電流，提示ET可能通過抑制初級感覺皮層神經(jīng)元Na+通道，降低神經(jīng)元興奮性[2]，而ET影響小腦皮層神經(jīng)元功能的文獻(xiàn)尚未見報道。小腦浦肯野細(xì)胞(purkinje cell，PC)是小腦皮質(zhì)的主要神經(jīng)細(xì)胞，其軸突構(gòu)成小腦皮質(zhì)的唯一的傳出路徑。因此，研究ET對小腦皮層自發(fā)性放電活動，是進(jìn)一步研究ET與小腦功能的基礎(chǔ)，也為深入闡明靜脈麻醉藥對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康ICR小鼠15只，6～8周齡，♀♂不拘，體質(zhì)量28 g～32 g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。依托咪酯和人工腦脊液(ACSF)。

1.2 儀器 美國產(chǎn)Axopatch-200B膜片鉗放大器、1440AD/DA轉(zhuǎn)換器、Clampex 10.3數(shù)據(jù)采集與分析軟件及MP-285微操縱器。膜片鉗專用顯微鏡(Nikon Eclipse E-600FN, Japan)與體視顯微鏡(Nikon,日本)等。

1.3 動物模型的制備 腹腔注射烏拉坦1.3 g·kg-1進(jìn)行麻醉，待角膜反射消失后行氣管切開，并置入自制氣管導(dǎo)管妥善固定，然后將小鼠置于特制的腦立體定位儀上，用雙側(cè)耳棒固定頭部，在小腦行開顱手術(shù)，開孔直徑約為1.0～1.5 mm，除去硬腦膜后暴露Vermis Vla/Vlb區(qū)，將小鼠和腦立體定位儀同時固定在顯微鏡下，確定需要記錄的部位后進(jìn)行電生理記錄。手術(shù)暴露腦表面部位采用蠕動泵持續(xù)腦表面灌流含95% O2+5% CO2混合氣體的人工腦脊液。在整個手術(shù)和電生理記錄過程中，使用體溫恒溫儀和加熱墊將小鼠體溫維持在(37.0±0.2)℃。

1.4 PC放電記錄 浦肯野細(xì)胞貼附式記錄使用Multiclamp700B放大器，通過D/A轉(zhuǎn)換器1440和Clampfit 10.3軟件獲取浦肯野細(xì)胞自發(fā)性活動數(shù)據(jù)。待自發(fā)放電活動穩(wěn)定后開始記錄，觀察ET對小鼠小腦皮層PC自發(fā)性單純放電頻率影響濃度依賴性時，用7只ICR小鼠，腦表面ET 5、50、100、300 μmol·L-1，各灌流10 min，每次藥物濃度增加之前，需用人工腦脊液沖洗30 min；觀察ET對小鼠小腦皮層浦肯野細(xì)胞自發(fā)放電活動時，用8只ICR小鼠，腦表面灌流300 μmol·L-1。在細(xì)胞貼附式記錄條件下，浦肯野細(xì)胞是通過其獨特的自發(fā)性單純峰電位和復(fù)雜峰電位放電模式來認(rèn)定的。

2 結(jié)果

2.1 ET降低PC的SS的放電頻率并具有濃度依賴性 小腦表面灌流5 μmol·L-1的ET浦肯野細(xì)胞SS放電頻率并沒有產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05)，50、100 μmol·L-1的ET對PC的SS放電率與對照組相比明顯抑制分別為(41.02±6.25)%、(72.45±6.46)%(P<0.05)，300 μmol·L-1ET完全抑制浦肯野細(xì)胞的SS放電(P<0.05)，50%的抑制濃度(IC50)為62.91 μmol·L-1。結(jié)果顯示小腦表面給予ET降低浦肯野細(xì)胞單純峰電位的放電頻率，其抑制作用具有濃度依賴性。

2.2 ET對浦肯野細(xì)胞自發(fā)性單純峰電位放電頻率的影響 給予300 μmol·L-1的ET完全抑制浦肯野細(xì)胞自發(fā)性單純峰電位放電頻率，自發(fā)性放電頻率由給藥前的(100.02±6.46)%降低到(8.90±3.26)%，沖洗后基本恢復(fù)到給藥前水平。

2.3 ET對自發(fā)性復(fù)雜峰電位波形特征和小穗數(shù)量的影響

300 μmol·L-1的ET完全抑制浦肯野細(xì)胞自發(fā)性單純峰電位放電，使自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電小穗數(shù)量減少。

3 討論

小腦皮層由分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層構(gòu)成，主要包括浦肯野細(xì)胞PC、分子層中間神經(jīng)元(molecular layer interneuron，MLI)、顆粒細(xì)胞(granule cell，GC)和高爾基細(xì)胞(Golgi cell)，其中顆粒細(xì)胞為興奮性神經(jīng)元，以谷氨酸為神經(jīng)遞質(zhì),其余均以GABA作為神經(jīng)遞質(zhì)的抑制性神經(jīng)元。

小腦皮層將來自脊髓，腦干和大腦皮層的傳入投射，經(jīng)精密運算與整合后，由PC發(fā)出各種輸出指令，控制軀體的平衡和眼球的運動，協(xié)助大腦皮層控制隨意運動，參與隨意運動的設(shè)計與編程以及運動記憶能力。小腦皮層主要通過苔狀纖維和爬行纖維傳入外部信息，參與精細(xì)運動調(diào)節(jié)和運動學(xué)習(xí)。一般認(rèn)為，經(jīng)苔狀纖維傳入的感覺信息通過顆粒細(xì)胞的軸突——平行纖維途徑來間接地興奮PC，表現(xiàn)為簡單峰電位(simple spike),而經(jīng)爬行纖維傳入的感覺信息可興奮PC,表現(xiàn)為復(fù)雜峰電位(complex spikes)[3]。

ET降低PC的SS的放電頻率并具有濃度依賴性，300 μmol·L-1ET完全抑制浦肯野細(xì)胞的SS放電，故我們在研究ET對浦肯野細(xì)胞自發(fā)性單純峰電位放電頻率及自發(fā)性復(fù)雜峰電位波形特征和小穗數(shù)量的影響時，選用的ET濃度為300 μmol·L-1。

在哺乳動物小腦皮層，BC的軸突末梢包裹在PC的胞體和軸突起始段，其興奮可使PC產(chǎn)生迅速而強(qiáng)烈的環(huán)胞體抑制，直接影響PC峰電位的輸出，而SC的軸突選擇性地與PC樹突形成抑制性突觸聯(lián)系，SC興奮可對PC樹突產(chǎn)生抑制，分流平行纖維的興奮性傳入，平衡PC樹突的興奮性[4]。因此，我們推測ET明顯抑制小腦PC自發(fā)性單純放電頻率，可能與ET增強(qiáng)BC和SC自發(fā)性活動有關(guān)。

我們應(yīng)用在體電生理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)，ET降低在體浦肯野細(xì)胞的單純峰電位放電頻率并具有濃度依賴性，ET(300 μmol·l-1)完全抑制自發(fā)性單純性放電，但自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電依然存在。ET(300 μmol·L-1)不僅完全抑制自發(fā)性單純性放電，而且抑制自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電小穗數(shù)量。在以后的研究中，有必要研究ET對小腦神經(jīng)元環(huán)路、感覺信息傳遞及突觸可塑性的影響，進(jìn)一步探討ET麻醉作用的細(xì)胞與分子機(jī)制。

綜上所述，在體條件下腦表面灌流ET明顯抑制浦肯野細(xì)胞自發(fā)放電活動。

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Effects of etomidate on spontaneous activity of cerebellar Purkinje cellinvivoin mice

QUAN Jie1，QIU De-lai2，CHU Chun-ping2，BING Yan-hua2，JIN Wen-zhe1

(1.DeptofPain,AffiliatedHospitalofYanbianUniversity；2.CellularFunctionResearchCenter，DeptofPhysiologyandPathophysiology,CollegeofMedicine，YanjiJilin133000，China)

依托咪酯；小腦；浦肯野細(xì)胞；細(xì)胞貼附式記錄；神經(jīng)藥理學(xué)；小鼠

etomidate；cerebellum；Purkinje cell；cell attached recording；neuropharmacology；mice

2016-09-14,

2016-11-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81560194)；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項目(吉教科合字2016第267號)；延邊大學(xué)科技發(fā)展計劃項目(延大科合字2014第38號)

全 杰(1989-)，男，碩士生，研究方向：神經(jīng)病理性疼痛的電生理機(jī)制，E-mail:834982812@qq.com； 金文哲(1971-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：靜脈麻醉藥對小腦皮層功能的影響，通訊作者，E-mail: jinwz@ybu.edu.cn

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.054.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.027

A

1001-1978(2017)03-0440-02

R-332;R322.81;R329.24;R971.2