李 朝

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

奶牛隱性乳腺炎診斷技術(shù)研究概況

李 朝

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

目前，奶牛乳腺炎診斷檢測(cè)技術(shù)大致可分為臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。奶牛隱性乳腺炎診斷檢測(cè)包括乳汁病原微生物分離鑒定、乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)、乳汁pH檢測(cè)、乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)、乳汁酶活性檢測(cè)、乳汁主要致病菌PCR檢測(cè)，以及檢測(cè)乳清總蛋白、血清白蛋白、被毛微量元素含量檢測(cè)等方法。本文對(duì)當(dāng)前奶牛隱性乳腺炎診斷檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展作簡(jiǎn)明概述，以供參考。

奶牛 隱性乳腺炎 診斷方法 檢測(cè)技術(shù) 進(jìn)展

奶牛乳腺炎（mastitis）又稱乳腺炎，是奶牛乳腺受到物理、化學(xué)、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳腺炎癥，主要表現(xiàn)為乳汁發(fā)生理化性質(zhì)及細(xì)菌學(xué)變化、乳腺組織發(fā)生病理學(xué)變化，是奶牛養(yǎng)殖中最為常見、最難防治、花費(fèi)最多、嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展的疾病之一[1]。在當(dāng)前奶牛乳腺炎的治療中，大量使用抗生素，導(dǎo)致牛奶的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，我國(guó)乳制品新增消費(fèi)的80%為進(jìn)口產(chǎn)品所占，養(yǎng)殖效益受損，嚴(yán)重制約我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為促進(jìn)奶業(yè)振興發(fā)展，保障優(yōu)質(zhì)安全乳品有效供給，加快建設(shè)現(xiàn)代奶業(yè)，2016年12月26日，根據(jù)《乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理?xiàng)l例》，農(nóng)業(yè)部、國(guó)家發(fā)展改革委、工業(yè)和信息化部、商務(wù)部、食品藥品監(jiān)管總局共同組織制定了《全國(guó)奶業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2016－2020年）》，奶牛乳腺炎防治及其診斷檢測(cè)技術(shù)成為奶牛養(yǎng)殖過程中的重要環(huán)節(jié)。

美國(guó)乳腺炎委員會(huì)（NMC）在1978年，根據(jù)乳汁和乳房的肉眼可見變化情況，將乳腺炎分為隱性乳腺炎和臨床型乳腺炎兩種，其中隱性乳腺炎占總發(fā)病的77%～79%，臨床型乳腺炎占奶牛總發(fā)病的21%～23%[2]。我國(guó)奶牛乳腺炎的發(fā)病率一般在20%～75%，其中臨床型乳腺炎發(fā)病率在9.7%～55.6%，而隱形乳腺炎發(fā)病率卻高61.03%～79.62%，給我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)、奶制品加工企業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。奶牛乳腺炎是由多種致病性病原微生物感染而引發(fā)，致病菌包括球菌、桿菌、支原體及病毒等多達(dá)150多種，臨床上較常見的約有23種，其中主要以鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為主，約占總致病菌的90%～95%[3-5]。

當(dāng)前，對(duì)奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療有大量的試驗(yàn)和報(bào)道，由于隱性乳腺炎的特殊性，多無肉眼可見的臨床癥狀，前期不易發(fā)現(xiàn)，容易延誤治療，隨著病情發(fā)展成為臨床型乳腺炎。本文將從診斷技術(shù)方面對(duì)奶牛乳腺炎研究概況作討論。

1 臨床診斷

1.1 臨床觀察診斷

肉眼觀察乳房的皮膚色澤、乳區(qū)形狀、乳汁性質(zhì)以及全身反應(yīng)。乳房皮膚表現(xiàn)為紅熱腫脹，乳區(qū)形狀不對(duì)稱，乳汁色澤異常，出現(xiàn)凝塊、絮片或膿汁，有時(shí)也出現(xiàn)染血。乳汁出現(xiàn)凝塊、絮片時(shí)，時(shí)常出現(xiàn)顏色的變化，表明乳腺有嚴(yán)重的炎癥。發(fā)生乳腺炎時(shí)，因病因、病程的不同，可出現(xiàn)發(fā)熱、腫脹、纖維化等癥狀[6]。

1.2 臨床觸摸診斷

用手觸摸待檢乳區(qū)質(zhì)地、溫度異常，對(duì)比四個(gè)乳區(qū)之間有明顯的溫度差異，乳房?jī)?nèi)是否有腫塊，觀察奶牛觸診時(shí)疼痛是否敏感。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 乳汁病原微生物分離鑒定

采集奶牛乳汁，用鑒定培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)分離和純化，觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢以及生化實(shí)驗(yàn)等，對(duì)所含病原菌進(jìn)行初步判斷。詳細(xì)的病原菌分離可參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。袁永隆等報(bào)道，奶牛隱性乳腺炎的主要病原菌為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金色葡萄球菌，大腸桿菌和乳房鏈球菌等，建立了dBASEⅢ“奶牛乳腺炎常見病原菌研究資料數(shù)據(jù)庫(kù)檢索系統(tǒng)”，制定了“奶牛乳腺炎細(xì)菌的分離和鑒定程序”，為乳汁的病原菌監(jiān)測(cè)提出可靠的檢驗(yàn)方法[7]。高潮等報(bào)道，引起奶牛隱性乳腺炎的主要病原菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌以及克雷伯菌[8]。該方法分離到的致病菌種類較多，但有些不是致病菌，存在一定的隨機(jī)性。

2.2 乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)法

體細(xì)胞是指來源于身體的細(xì)胞，主要是白血細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等）和乳房組織的分泌細(xì)胞，國(guó)際上通常以每毫升奶中體細(xì)胞數(shù)SCC/ml表示。正常體細(xì)胞數(shù)（SCC）牛奶中含2萬/ml～20萬/ml，國(guó)際上規(guī)定以50萬/ml以上的體細(xì)胞數(shù)定為乳腺炎的基準(zhǔn)[9]。體細(xì)胞計(jì)數(shù)法分為直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。直接計(jì)數(shù)法常用顯微鏡及電子對(duì)體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)。間接計(jì)數(shù)法原理是對(duì)體細(xì)胞裂解，使DNA釋放出來，產(chǎn)生沉淀或者形成凝膠，體細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)生的沉淀和凝膠正相關(guān)，間接計(jì)算乳汁中體細(xì)胞數(shù)量和判斷奶牛乳腺炎[10]，包括以加州乳腺炎CMT檢驗(yàn)法為基礎(chǔ)的中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州中獸醫(yī)研究所LMT法、吉林乳腺炎JLT檢驗(yàn)法、北京奶牛研究所BMT檢測(cè)法、上海奶牛研究所SMT檢測(cè)法、 西北農(nóng)林科技大學(xué)YMT診斷液、黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所HMT檢測(cè)法，以及浙江大學(xué)HMT診斷粉檢測(cè)法、 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所JMT診斷粉檢測(cè)法。以上檢測(cè)方法大多都制成試劑盒，使用時(shí)根據(jù)實(shí)際情況合理選用，按照使用說明書操作即可。其中LMT檢測(cè)法，結(jié)果誤差較小，且較為方便快速，是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的良好方法[11]。

2.3 乳汁pH檢測(cè)

正常乳汁pH值在6.2～6.6之間，隨著炎癥反應(yīng)的加重，血管滲透性增加，pH值變化與體細(xì)胞和炎性細(xì)胞的含量呈正相關(guān)，導(dǎo)致牛乳pH逐漸升高，趨向于血液pH值。該方法可用酸度計(jì)或者用特制的試紙進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單快速，但結(jié)果可能會(huì)受環(huán)境溫度、胎次等因素影響，而出現(xiàn)較大誤差。如果pH值在6.6～6.8之間，不能直接判定為陽性，必須結(jié)合使用其他的檢測(cè)方法，綜合診斷。

2.4 乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)

當(dāng)奶牛患乳腺炎后，乳腺上皮組織細(xì)胞制造乳糖能力下降，乳汁滲透壓下降，Na+、K+、Ca2+和Cl-等離子的濃度升高，乳汁電導(dǎo)率（EC）的升高。從20世紀(jì)40年代開始，日本率先研制出便攜式袖珍電子診斷儀，赫慶銘推出SX-Ⅰ型乳腺炎診斷儀，可區(qū)分健康乳、可疑乳、隱性乳腺炎輕度乳、中度乳、重度乳等五類乳汁，還可初步測(cè)定出乳汁的營(yíng)養(yǎng)成分。CN乳腺炎診斷儀體積小，除能區(qū)分上述五種奶外，還可區(qū)分牛奶的品質(zhì)，分別為最佳健康乳、一般健康乳和次健康乳。XND-A型奶檢儀，是一種導(dǎo)電極為傳感器的便攜式奶檢儀，體積小，能快速、準(zhǔn)確的檢出摻假奶（如摻水）、酸敗奶、有抗生素奶和乳腺炎奶[12]。但是，在實(shí)際的運(yùn)用中，由于電導(dǎo)率受到飼料成分、泌乳期、月份和胎次等因素影響，變動(dòng)范圍較大，應(yīng)對(duì)具體因素進(jìn)行區(qū)分研究，掌握變化規(guī)律，制定具體細(xì)化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，提高診斷檢測(cè)準(zhǔn)確率。

2.5 乳汁酶活性檢測(cè)

在乳腺細(xì)菌感染時(shí)，很多內(nèi)在的酶含量會(huì)有所上升。目前常用于奶牛隱性乳腺炎診斷的酶指標(biāo)主要有乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、乳過氧化物酶和脂酶等。酶活性的影響因素較多，溫度、時(shí)間、pH、介質(zhì)中的離子濃度、底物等均可造成酶活性的巨大差異[13]。郭昌明等報(bào)道檢測(cè)奶樣中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的濃度的方法更符合快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度、高特異性的現(xiàn)代診斷方法要求[14]。

2.6 乳汁主要致病菌PCR檢測(cè)

蔣成硯等用巢式PCR技術(shù)能檢測(cè)出乳房鏈球菌16S rRNA保守區(qū)的可變區(qū)序列，與生理生化鑒定結(jié)果一致，該方法能快速有效檢測(cè)出奶牛隱性乳腺炎乳房鏈球菌[15]。陳亞明等對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌三種主要致病菌的檢測(cè)靈敏度分別為 0.1pg/μl、0.01pg/μl、0.1pg/μl[16]。該方法結(jié)果靈敏準(zhǔn)確，可以檢測(cè)出早期的奶牛隱性乳腺炎。

2.7 其他方法

此外，除上述方法外，還可以通過檢測(cè)乳清總蛋白、血清白蛋白、被毛微量元素含量等來診斷奶牛隱性乳腺炎。這幾種方法，在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，由于操作難度大，儀器設(shè)備要求高，操作流程復(fù)雜，檢測(cè)技術(shù)不夠完善等原因，臨床運(yùn)用相對(duì)較少。

3 展望

目前，廣泛用于奶牛隱性乳腺炎檢測(cè)的方法有LMT法、體細(xì)胞計(jì)數(shù)法、電導(dǎo)率檢測(cè)法、pH測(cè)定等，其中LMT法操作更方便，運(yùn)用更廣泛?，F(xiàn)有的診斷檢測(cè)技術(shù)相對(duì)滯后，受到檢測(cè)費(fèi)用、儀器設(shè)備和養(yǎng)殖地區(qū)等現(xiàn)實(shí)問題的制約，難以在臨床養(yǎng)殖中廣泛推廣。同時(shí)，快速準(zhǔn)確、便捷實(shí)惠、特異靈敏和自動(dòng)化的奶牛隱性乳腺炎診斷檢測(cè)技術(shù)是未來研究開發(fā)的重點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)，對(duì)于深入全面實(shí)施《全國(guó)奶業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2016-2020年）》具有重要意義。隨著科研的不斷深入，診斷檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步，減少奶牛隱性乳腺炎的發(fā)生，提高牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，提升中國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)在國(guó)內(nèi)和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的目標(biāo)必將實(shí)現(xiàn)。

[1]關(guān)宇晶，侯振中.奶牛乳腺炎防治研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2013（08）：49-51.

[2]薛永康，王新莊，閆躍飛，等.奶牛乳腺炎診斷方法研究進(jìn)展[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2016（08）：15-18.

[3]Cagnardi P，Locatelli C，F(xiàn)erraresi C，et al.Pharmacokinetics in foremilk and antimicrobial activity of cephapirin following intramammary administration in healthy and Staphylococcus aureusinfected cows[J].NEW ZEALAND VETERINARY JOURNAL，2014，62（3）：146-151.

[4]Hertl J A，Schukken Y H，Welcome F L，et al.Pathogen-specific effects on milk yield in repeated clinical mastitis episodes in Holstein dairy cows[J].JOURNAL OF DAIRY SCIENCE，2014，97（3）：1465-1480.

[5]袁永隆，張禮華，劉純傳，等.我國(guó)奶牛乳腺炎常見病原菌的區(qū)系調(diào)查[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992（04）：70-76.

[6]趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)（第四版）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008：506-507.

[7]袁永隆，張禮華，劉純傳，等.我國(guó)奶牛乳腺炎常見病原菌的區(qū)系調(diào)查[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992（04）：70-76.

[8]高潮，劉國(guó)慶，連英琪，等.奶牛隱性乳腺炎病原菌的分離鑒定與DGGE追溯[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2013（03）：88-94.

[9]楊柏齡.奶牛隱性乳腺炎的檢測(cè)[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2013（02）：55.

[10]馮萬宇，周慶民，徐馨，等.奶牛體細(xì)胞裂解方法的研究進(jìn)展[J].養(yǎng)殖與飼料，2016（10）：6-7.

[11]張廣斌.奶牛隱性乳腺炎檢測(cè)方法的比較研究[J].山東畜牧獸醫(yī)，2012（08）：6-8.

[12]肖連明，聶玉霞，項(xiàng)開合.奶牛乳腺炎診斷方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2007（06）：64-67.

[13]楊德英，曹隨忠，余樹民，等.乳酶LDH作為奶牛隱性乳腺炎早期診斷指標(biāo)的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009（06）：761-764.

[14]郭昌明，張乃生，周昌芳，等.髓過氧化物酶檢測(cè)奶牛隱性乳腺炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006（06）：54-57.

[15]蔣成硯，劉杰，李橋善，等.奶牛隱性乳腺炎乳房鏈球菌巢式PCR檢測(cè)方法的建立[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2016（05）：955-958.

[16]陳亞明，杜玉蘭，聶培，等.奶牛乳腺炎3種主要致病菌三重PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2014（07）：82-85.