薛 麒 吳思捷 張瑩輝 康 凱 印春生 姚文生 陳小云

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

牛病毒性腹瀉病毒檢測研究進展

薛 麒 吳思捷 張瑩輝 康 凱 印春生 姚文生 陳小云*

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

牛病毒性腹瀉病給養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失，檢測牛病毒性腹瀉病毒對于養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展非常重要。本文綜述了近年來檢測牛病毒性病毒的檢測方法，并歸納這些方法的優(yōu)缺點。建議檢測人員結合該病診斷檢測的實際需要，合理使用牛病毒性腹瀉病毒的各種檢測方法。

牛病毒性腹瀉病毒 檢測 進展

0 引言

牛病毒性腹瀉又稱牛黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒引起的牛發(fā)生黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉的一種急性傳染病。牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV），又名黏膜病病毒（Mucosal Disease virus，MDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒在基因結構和抗原特性存在高度同源。牛病毒性腹瀉給養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的危害，同時該病病毒也能感染豬、山羊等其他動物，給該病的預防診斷造成很多困難。

1 病原學檢測

1.1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是一種常見檢測BVDV的方法，多種牛源細胞如牛腎、脾、睪丸和氣管等細胞均可用于該病毒的分離。其中牛腎細胞（MDBK）是用于分離BVDV最常用的細胞之一。病毒分離依據(jù)BVDV引起的典型細胞病變來判斷，根據(jù)病毒對細胞的致病性將BVDV分為致細胞病變型（CP型）和非致細胞病變型（NCP型）。通常將病料接種于牛腎細胞（MDBK）等細胞培養(yǎng)物中，盲傳幾代后觀察細胞的病變情況。但這種分離培養(yǎng)方法只適用于致細胞病變型的BVDV的分離鑒定，對于非細胞致病變型的無法通過細胞病變情況來判斷，需要通過其他診斷方法進一步檢測。包振中等在新疆北疆地區(qū)采集到BVDV疑似病例的糞便，通過細胞分離培養(yǎng)，接種于密度約為80%的單層MDBK細胞出現(xiàn)了細胞病變，盲傳5代至出現(xiàn)BVDV典型的細胞病變。侯佩莉等也從BVDV疑似病牛的糞便中分離得到一株病毒能使MDBK細胞才產(chǎn)生細胞病變，經(jīng)過進一步鑒定證實，確定該病毒為BVDV。鄧宇等將處理后的BVDV陽性仔豬組織樣品接種于MDBK細胞，分離得到一株豬源BVDV，命名為SD0803株，該株在MDBK細胞上盲傳至13代，沒有出現(xiàn)細胞病變。但在直接免疫熒光試驗中呈陽性，PCR檢測證實為BVDV，故該毒株為非細胞致病變型。

1.2 電鏡觀察鑒定

電鏡技術是病毒學研究和病毒診斷的技術之一，電鏡技術對病毒粒子的數(shù)量要求比較高，最低數(shù)量要達到107個/ml。包振中等對分離得到的BVDV通過免疫電鏡觀察到大量呈球形的BVDV粒子，大小為20～40nm。趙月蘭等也在奶牛場BVDV疑似病例中采集病料，分離培養(yǎng)后，用電鏡觀察到圓形、直徑為40～60nm，有囊膜，囊膜表面有突起的病毒粒子，與BVDV顆?；疽恢隆?/p>

2 血清學檢測

2.1 中和試驗

中和試驗是牛病毒性腹瀉病流行病學特異性抗體的檢查方法之一。對疑似病牛間隔2～4周分兩次采血，血清倍比稀釋后進行中和試驗，檢查血清中和抗體效價，滴度升高4倍以上即判定為陽性。這種方法不僅能定性檢測還能定量，其檢出率較瓊脂擴散試驗高，重復率好，適用于實驗室檢測。此外，也可使用細胞水平上的中和試驗，即用已知的BVDV與被檢血清作用后接種細胞，觀察細胞病變情況。這種方法適用于BVDV流行病學調(diào)查。

2.2 免疫瓊脂擴散試驗

免疫瓊脂擴散試驗通常采用未經(jīng)處理的發(fā)炎或糜爛組織周圍的黏膜，直接與BVDV陽性血清發(fā)生反應，也可取待檢血清與標準陽性抗原進行抗體檢測。該方法簡單易行，在國內(nèi)基層獸醫(yī)應用廣泛，但其不具備株特異性，準確率不高，易造成漏檢。

2.3 免疫過氧化物酶技術

免疫過氧化物酶（IP）技術可應用于檢測BVDV抗原的總體分布、檢測和血清抗體的檢測，是可靠的牛病毒性腹瀉病診斷方法之一。Katz等建立了一種用于監(jiān)測細胞培養(yǎng)物BVDV感染的間接免疫過氧化酶染技術。感染的單層細胞被濃染，而沒有感染的單層細胞無色，顯微鏡和肉眼都可以觀察。該技術方法具有良好的敏感性和特異性。

2.4 免疫熒光技術

免疫熒光技術是運用抗原與抗體結合的原理和特殊的標記技術，對特異性抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測的一門技術。通常使用直接免疫熒光法檢測感染細胞培養(yǎng)物中的病毒粒子，熒光顆粒出現(xiàn)于胞漿中，并可用未標記抗體進行熒光抑制試驗做進一步鑒定。此外，也可使用間接免疫熒光法檢測血清中的抗體。該技術方法具有敏感性高、速度快、特異性強等優(yōu)點，適合檢查NCP型的BVDV細胞培養(yǎng)物，但由于存在非特異性染色的情況，會導致結果判定發(fā)生偏差，同時因為技術操作較為復雜和對儀器設備的要求較高，因此不適用于基層獸醫(yī)的實際檢測。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是用物理方法將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，用酶標記抗原或抗體，使抗原抗體在固相載體發(fā)生反應，通過免疫酶測定來判斷結果。ELISA是檢測BVDV以及體內(nèi)抗體水平的一種良好技術。范晴等用兔抗BVDV多抗作為包被抗體，BVDVNS3單克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測BVDV抗原的捕獲ELISA方法。特異性和敏感性試驗結果表明，該方法對牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛分支桿菌無特異性交叉反應，其最低可檢測7.9×105個TCID50的病毒量，與RT-PCR方法的相比較，符合率為100%。所建立的BVDV抗原捕獲ELISA方法快速、特異、敏感，可用于BVDV抗原的檢測。張寧等采用辛酸-硫酸銨法提取兔抗BVDV高免血清中的免疫球蛋白IgG，在混合硝酸纖維素膜上進行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗，建立了檢測BVDV抗原的斑點酶聯(lián)免疫吸附檢測法。應用建立的檢測方法對78份腹瀉奶牛血樣進行了檢測，陽性檢出率為58.97%；經(jīng)卡方（χ2）檢驗分析，建立的間接Dot-ELISA與瓊脂擴散試驗（AGP）法相比較，陽性檢出率差異顯著。證實該方法敏感性高、簡便快速，適合于基層獸醫(yī)的檢測診斷。李文文等]將2種BVDV：CP型（BVDVOregonC24株）和NCP型（BVDVYak株），滅活、濃縮作為抗原，分別免疫家兔制備高免血清，同時使用BVDV全病毒蛋白作為包被原，建立了檢測BVDV的間接ELISA檢測方法。通過間接ELISA檢測方法比較了兩種細胞致病型的免疫原性。柴順秀等用BVDV重組E2蛋白為包被抗原，辣根過氧化物酶標記葡萄球菌A蛋白（PPA）為二抗，建立了檢測BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法。通過重復性試驗、特異性試驗和敏感性試驗證明，與用BVDV全病毒為抗原的IDEXXELISA試劑盒相比，建立的E2-PPA-ELISA抗體檢測方法具有較好的重復性、敏感性和特異性。對285份不同地區(qū)采集的血清樣本進行檢測，陽性檢出率為33.4%，與IDEXXELISA試劑盒的檢出率無明顯差異。表明該方法為BVDV的快速診斷和流行病學調(diào)查提供一種快速、簡便的血清學診斷方法，適合規(guī)?；B(yǎng)牛場BVDV的抗體監(jiān)測以及流行病學調(diào)查。

3 分子生物學檢測

3.1 核酸雜交技術

核酸雜交技術是20世紀80年代興起的一種分子生物學檢測技術，包括DNA印記雜交和RNA印跡雜交。其原理是把DNA或RNA轉(zhuǎn)移固定在硝酸纖維素膜上，與其互補的單鏈DNA或RNA探針用放射性或非放射性物質(zhì)標記。與血清學等傳統(tǒng)的檢測方法相比，核酸雜交技術應用廣泛，敏感性高，特異性強。早期的放射性同位素標記探針，其具有放射性危害、不穩(wěn)定等缺點。后來發(fā)明的生物素標記的DNA探針雖然不具有放射性危害，但其特異性和敏感性有時均不如放射性同位素標記探針?，F(xiàn)在較多使用地高辛標記核酸探針，其敏感性不僅與同位素標記探針相當，特異性又明顯高與生物素標記探針。王偉利等建立了地高辛標記核酸探針檢測BVDV的診斷方法。根據(jù)BVDV基因序列的結構特點，在編碼非結構蛋白p125高度保守基因區(qū)內(nèi)，設計合成一對特異性引物，以PCR技術從BVDV基因重組質(zhì)粒中擴增出了BVDV特異的、保守的400bp核苷酸片段，經(jīng)純化后，地高辛標記，制備BVDV的特異性核酸探針。通過檢測BVDV細胞培養(yǎng)物、相關病毒及核酸載體和BVDV細胞培養(yǎng)物的總RNA、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及RT-PCR產(chǎn)物，結果證明，該探針特異性強、敏感性高，適于病毒反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測。

3.2 轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

根據(jù)已知的BVDV的基因序列設計合成一對或數(shù)對引物，用RT-PCR方法可以高度靈敏、特異快速地檢測待檢物中的BVDV。該方法可以有效檢測出BVDV，同時也能區(qū)分細胞病變型，也能與其他同屬病毒區(qū)別。王偉利等實時定量熒光參考BVDV5’端非結構蛋白基因序列，設計合成1對特異性引物，建立檢測BVDV244bp片段的RT-PCR一步法。該方法對BVDVNADL、Oregon C24V和長春184毒株各標準毒株檢測，結果均為陽性。對標準毒株的細胞毒進行檢測，其敏感度達0.1TCID50；而對牛傳染性鼻氣管炎病毒、豬瘟病毒、牛輪狀病毒和牛冠狀病毒的細胞培養(yǎng)物進行檢測，結果均為陰性。檢測460份不同樣品，與病毒分離試驗比較，符合率100%，證明該方法特異性強，敏感性高。李晶梅等Gen Bank上牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒兩種病毒標準株的基因組序列，選取各自的保守基因區(qū)域設計可以進行鑒別檢測的特異性引物，經(jīng)過對PCR反應條件的優(yōu)化，建立了可以對2種病毒同時檢測的雙重RT-PCR方法。該方法對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬圓環(huán)病毒2型的擴增結果均為陰性；該檢測方法的敏感性為5ng病毒基因組RNA。所建立的這種雙重RTPCR檢測方法特異性強、敏感性高，可以用于兩種疾病的檢測，也為兩種病毒的交叉污染的檢測提供一種方便、快捷的方法。王克棟等根據(jù)Gen Bank已發(fā)表的BVDV基因1型和2型毒株的5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）保守序列的差異，設計2對特異性引物，并以牛GAPDH基因為內(nèi)標，設計1對特異性引物，建立BVDV分型與內(nèi)標三重RT-PCR檢測方法。3對引物可分別擴增出的片段大小為127、94、152bp，與預期大小相符。經(jīng)反應條件優(yōu)化，該方法的靈敏度為100TCID50，與不加內(nèi)標檢測靈敏度相當。經(jīng)臨床樣品檢測驗證，該方法具有較好的特異性和重復性，可用來對BVDV分型進行快速準確的檢測。

3.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。郭銳等以BVDV的保守基因序列，設計、優(yōu)化出一對特異性引物和一條Taq Man熒光探針，簡歷了一種快速定量檢測BVDV的實時熒光定量PCR方法。該方法檢測靈敏度比RT-PCR高100倍，同時避免了普通PCR電泳檢測帶來的污染。張淑琴等在BVDV5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）設計并合成了1對引物，建立了可以定量檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的SYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法。該方法建立的標準曲線相關系數(shù)R2為0.999，擴增效率為95.9%，熔解曲線為單一峰值，可檢測到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹瀉病毒核酸，是常規(guī)RTPCR方法敏感性的100倍。陳其兵等同樣也根據(jù)BVDV基因序列設計合成引物和Taq Man熒光探針，建立了熒光定量RT-PCR檢測方法。通過對20份胎牛血樣和豬瘟細胞苗半成品的檢測，該方法具有快速、特異、靈敏和重復性好等特點。實時熒光定量PCR技術跟常規(guī)RT-PCR 方法相比，其特異性更強，能有效解決PCR污染問題，其自動化程度也比較高，但該方法對儀器要求高，有時存在假陽性的情況。

4 小結

隨著各種檢測技術的發(fā)展，BVDV的檢測在不斷完善和進步。如免疫膠體金的應用促進了病毒檢測技術的發(fā)展，在BVDV的檢測研究中也在不斷進步。BVDV的檢測對養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展至關重要，各種檢測技術各有優(yōu)劣，需要結合實際加以運用，正確地檢測牛群中BVDV的情況，減少牛病毒性腹瀉病帶來的損失。

[1]吳清民.獸醫(yī)傳染病學[M].北京，中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2002：133.

[2]童欽，霍志云，胡桂學，等.牛病毒性腹瀉病毒檢測方法的研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2012，28（14）：79-83.

[3]張寧，秦建華，趙博偉，等.牛病毒性腹瀉-黏膜病診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2008，29（2）：93-97.

[4]包振中，雷程紅，蔡元慶，等.牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒分離鑒定及生物學特性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（9）：2391-2398.

[5]侯佩莉，楊宏軍，宋玲玲，等.牛病毒性復學病毒山東株的分離與鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2013，45（2）：41-44.

[6]鄧宇，孫春清，張宏彪，等.1株豬源牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報，2012，43（3）：416-423.

[7]趙月蘭，楊漢春，左玉柱，等.河北省奶牛牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒的分離鑒定[J].中國動物檢疫，2006，23（11）：29-32.

[8]曹安民，黃顯明，郭保國.牛病毒性腹瀉病實驗室診斷方法的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2011，32（1）：74-75

[9]吳明福，王金良，孫進華.牛病毒性腹瀉檢測技術研究進展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2006，（4）：54-56.

[10]Katz J A，Maanen C，Wetering G S，et al. Simple rapid and reliable enzyme linked immunosothent assay for the detection of bovine viral diarrhea virus（BVDV）specific antibodies in cattlr serum，plasma and bulk milk[J]. Vet Miorobiol，1999，64（23）：135-144.

[11]范晴，謝芝勛，謝志勤，等.牛病毒性腹瀉抗原捕獲ELISA方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2015，36（2）：21-24.

[12]張寧，趙月蘭，趙博偉，等.牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒斑點酶聯(lián)免疫吸附檢測法的建立[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2011，（5）：9-11.

[13]李文文，劉情，劉亞剛.牛病毒性腹瀉病毒間接ELISA方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（3）：558-562.

[14]柴順秀，馬花，韓英，等.牛病毒性腹瀉病毒重組E2蛋白PPAELISA方法的建立及臨床應用[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（6）：106-110.

[15]王偉利，錢愛東，胡桂學，等.地高辛標記核酸探針檢測牛黏膜病病毒[J].中國獸藥雜志，2000，34（5）：1-4.

[16]王偉利，肖成蕊，孟日增，等.牛病毒性腹瀉病毒一步法RTPCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（10）：806-809.

[17]李晶梅，劉丹，薛霜，等.豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應用[J].動物醫(yī)學進展，2014，35（4）：66-71.

[18]王克棟，熊浩，季新成，等.牛病毒性腹瀉病毒1型和2型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（10）：21-25.

[19]郭銳，陳平，田永祥，等.快速檢測牛病毒性腹瀉病毒實時熒光定量PCR技術建立及應用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（8）：1640-1643.

[20]張淑琴，譚斌，李鵬，等.牛病毒性腹瀉病毒Real-timePCR方法的建立及其應用[J].特產(chǎn)研究，2014，（3）：1-4.

[21]陳其兵，薛霜，漆世華，等.牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒Taq Man熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國獸藥雜志，2012，46（4）：4-6，47.

十三五國家重點研發(fā)計劃項目“牛羊重要疫病診斷與檢測新技術研究”（2016YFD0500906）

薛 麒，男，研究實習員。

陳小云，男，副研究員。