于新友 ，李天芝 ，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

病毒樣顆粒(Virus like particles，VLPs)是由病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白在異源系統(tǒng)內(nèi)重組表達，并在該系統(tǒng)內(nèi)或系統(tǒng)外自動裝配成的一種不含病毒核酸的高度結(jié)構(gòu)化空心顆粒[1]。VLPs大小介于15～400 nm之間[2]，形態(tài)上類似于真正的病毒粒子，不含病毒核酸，無法復制和擴增，因此，不具有感染性，安全性好[3]。VLPs保留了天然病毒粒子的空間構(gòu)象和誘導中和抗體的抗原表位，免疫原性強，可模擬病毒感染途徑，被呈遞給免疫細胞，激發(fā)機體細胞免疫、體液免疫及黏膜免疫等免疫應答。VLPs具有病原體相關模式分子的活性，也可激活固有免疫應答。VLPs疫苗作為一種新型的亞單位疫苗，具有穩(wěn)定性高、免疫原性好、安全性高[4]、適宜大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。與傳統(tǒng)疫苗相比，VLPs具有相當?shù)拿庖咴院透玫陌踩远蔀橐环N理想的疫苗形式，自從出現(xiàn)后就受到了人們的普遍重視，VLPs在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并將外源性抗原展示在其表面。此外，多數(shù)病毒VLPs還具有包裹核酸或其他小分子的能力，可作為基因或藥物的運載工具[5、6]，是研制安全高效的預防病毒性疾病的潛在候選疫苗。迄今為止，國內(nèi)外針對VLPs進行了大量的研究，本文就VLPs在豬病毒病防治應用方面的研究進行綜述，以期為豬病毒病的防控工作提供新的思路。

1 VLPs的免疫機制

與其他亞單位疫苗和重組蛋白疫苗相比，VLPs的免疫原性更強，可誘導機體產(chǎn)生體液免疫應答反應，主要是VLPs的抗原表位與天然病毒類似，并高度模仿了天然病毒的空間構(gòu)象，表面有可被B淋巴細胞表面受體識別的成分，活化B淋巴細胞，上調(diào)組織相容性復合體MHCⅡ類分子水平，刺激機體產(chǎn)生特異性中和抗體，從而誘發(fā)免疫反應。外源的VLPs也能通過交叉提呈的方式，通過MHC-Ⅰ類途徑進行提呈，從而活化CD8 T細胞，實現(xiàn)CD8細胞介導的保護性免疫反應，這對于清除細胞內(nèi)的病原體如病毒等至關重要。因在遞呈給樹突狀細胞加工、被MHCⅡ類分子展示以及直接引起樹突狀細胞成熟和遷移的過程中，VLPs的大小適合被樹突狀細胞(DCs)通過吞噬、滲透及Toll樣受體（TLR受體）介導等方式高效攝取，所以具有一定的免疫佐劑分子效應，單獨免疫動物就能誘導機體產(chǎn)生較強的免疫應答反應。VLPs能模擬天然病毒的體內(nèi)感染過程，從而激活抗原遞呈細胞，尤其是進入樹突狀細胞（DCs）后，能上調(diào)DCs的數(shù)量并促進其成熟，使其細胞表面分子如CD40、CD80、CD86及 MHC- Ⅰ 和Ⅱ類分子表達水平明顯上調(diào)，同時促進DCs分 泌 IL-6、IL-10、MIP-1α 及TNF-α等細胞因子，從而誘導機體產(chǎn)生細胞免疫應答。

2 豬病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進展

2.1 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，此外，PCV2還與豬呼吸道綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征和繁殖障礙以及腸炎等疾病有關，是一種免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[7]。趙曉云等[8]根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率表優(yōu)化合成PCV2 NJ株ORF2基因，將其插入原核表達載體pQZ1，鑒定陽性后轉(zhuǎn)入表達宿主菌BL21，對重組菌進行誘導表達。SDS-PAGE結(jié)果表明PCV2 NJ株優(yōu)化的ORF2基因在大腸桿菌中得到了高效表達，表達產(chǎn)物以完全可溶性形式存在于菌體超聲波破碎后的上清液中，Western-blotting分析結(jié)果顯示，表達的重組Cap蛋白能夠與PCV2陽性血清發(fā)生反應，電鏡觀察，可見大量直徑在17 nm左右的PCV2 VLPs存在于超聲破碎后的上清液中，500μg/頭重組VLPs疫苗免疫豬產(chǎn)生較高的抗體水平，單次免疫后21 d抗體100%達到合格，對PCV2強毒的攻擊提供完全保護。Chi等[9]采用同源重組技術構(gòu)建了含PCV2的Cap基因的重組PRV病毒株gE(-)/PCV2cap(+)PRV。通過間接免疫熒光試驗(IFA)和Westernblotting方法證實重組病毒復制過程中可表達Cap蛋白。電子顯微鏡結(jié)果顯示，所表達的Cap蛋白能組裝成VLPs。用純化的VLPs免疫小鼠和豚鼠可產(chǎn)生針對PCV2 Cap的特異性免疫應答。

2.2 豬口蹄疫

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物常發(fā)的一種烈性傳染病，豬口蹄疫臨床表現(xiàn)主要為蹄冠、趾間、蹄踵皮膚發(fā)生水泡和爛斑，部分豬口腔黏膜和鼻盤也有同樣病變。潘群興等[10]將O型FMDV VP1中編碼T細胞表位肽(aa21-aa40)序列連接于PPV VP2的5’端，并插入到桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-FMDVVP1-PPV-VP2，轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態(tài)DH10Bac中，經(jīng)藍白菌落篩選獲得重組桿狀病毒表達質(zhì)粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，轉(zhuǎn)染昆蟲草地夜蛾細胞(Sf9)，并在Sf9中進行了表達。電鏡觀察顯示，表達的重組蛋白能自我組裝成病毒樣顆粒，用IFA、Western-blotting分析表明，表達產(chǎn)物具有與PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫實驗證實，在低濃度FMDV抗原下能夠產(chǎn)生特異性T淋巴細胞增殖反應，而且該病毒樣顆粒能誘導機體產(chǎn)生抗FMDV特異性細胞免疫反應。董艷美等[11]根據(jù)豬源FMDV VP1上第141-160位氨基酸序列設計引物，利用重疊延伸PCR技術將該序列插入在大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點。然后連接到原核表達載體pET28a上，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒28a-CPVP1，轉(zhuǎn)化BL21，ITPG誘導表達得到融合表達的CP-VP1蛋白，透射電子顯微鏡下觀察融合蛋白CP-VP1成類VLPs狀。間接ELISA試驗證實該蛋白能夠特異地結(jié)合豚鼠抗O型FMDV的陽性血清，30 μg的 CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以誘導其產(chǎn)生高效價的特異抗體。竇小龍等[12]為制備Asia 1型FMDV雙層結(jié)構(gòu)病毒樣顆粒，選擇牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)流行株核心蛋白p14的第169-270位氨基酸FMDVAsia1/JS/CHA/05結(jié)構(gòu)蛋白VP1的第1-211位氨基酸，兩者之間設計柔性肽連接，人工合成p14-柔性肽-VP1融合蛋白編碼序列，全基因長990 bp。合成基因與枯草芽胞桿菌表達載體p7257-P43連接，構(gòu)建成表達質(zhì)粒p7257-P43-P14-VP1。轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌WB800，經(jīng)篩選、鑒定，獲得表達p14-VP1融合蛋白的枯草芽胞桿菌。該重組表達菌在含有40μg/mL氯霉素的LB中培養(yǎng)后，菌體超聲破碎可檢測到目的蛋白。Western-blotting結(jié)果顯示，該蛋白能特異性識別Asia 1型FMDV抗體，具有良好的反應原性。電鏡觀察顯示，融合蛋白組裝為直徑約50 nm大小的VLPs。盛蓉等[13]以兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60為載體，分別在RHDV衣殼蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之間插入FMDV B細胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合VP60基因。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達嵌合蛋白，分別命名為VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。通過電鏡觀察嵌合蛋白自聚為病毒樣顆粒的能力，動物免疫試驗結(jié)果顯示，將病毒樣顆粒免疫小鼠后均可產(chǎn)生針對VP60和B細胞表位特異的免疫應答。

2.3 豬細小病毒病

豬細小病毒病是由豬細小病毒(PPV)引起的母豬繁殖障礙性疾病，主要臨床表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，初產(chǎn)母豬受到的危害最為嚴重[14]。VP2是PPV的主要衣殼蛋白，具有良好的免疫原性，當用體外表達系統(tǒng)表達時能自我裝配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作為一種抗原的轉(zhuǎn)運載體，攜帶外源表位，組裝成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫動物具有雙重的免疫效果。Antonis等[15]用桿狀病毒產(chǎn)生豬細小病毒樣粒子，用低于1μg的該VLPs以油包水的形式分別免疫豚鼠和豬，均產(chǎn)生了很高的血清抗體滴度，僅用0.7 fg豬細小病毒樣粒子免疫母豬，一次免疫就可以保護胎兒不受致死劑量的PPV的攻擊。陳楊[16]擴增了PPV SC1株VP2基因，將其插入真核表達載體pPI-2.EG-FP中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pPI-2.EGFP.VP2。采用脂質(zhì)體介導法將豬偽狂犬病病毒(PRV)SA215株DNA與pPI-2.EGFP.VP2DNA共轉(zhuǎn)染Vero細胞獲得重組病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗體建立的免疫熒光技術可檢測到Vero細胞發(fā)出的特異性熒光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因組中，并獲得表達。進一步電鏡觀察表明，感染PRV SA215/VP2的Vero細胞中可同時觀察到PRV與PPV兩種VLPs。徐志文等[17]構(gòu)建了含PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重組質(zhì)粒pEGFPVP2.ORF2，由脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染Vero細胞，對轉(zhuǎn)染細胞進行電鏡檢測，結(jié)果觀察到VLPs存在。將純化后的VLPs免疫仔豬，檢測其血中T淋巴細胞的動態(tài)變化以及血清抗體水平。結(jié)果免疫仔豬的CD3、CD4 T淋巴細胞在外周血淋巴細胞中的比率均有一定程度的升高，CD8 T淋巴細胞在免疫后7～14 d有所下降，之后再升高?？贵w檢測結(jié)果表明，免疫動物血清中有較高水平的PPV、PCV2特異性抗體。

2.4 豬乙型腦炎

日本腦炎(JE)是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的感染性疾病，JEV可引起母豬繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。JEV基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb，含有三個結(jié)構(gòu)蛋白，衣殼蛋白(C)，膜前體蛋白(prM)和包膜糖蛋白(E)。其中prM蛋白成熟后被剪切成M蛋白，與病毒感染能力相關，是病毒誘發(fā)保護性免疫的重要協(xié)同成分，可產(chǎn)生微弱的中和抗體。E蛋白為糖蛋白，是誘導產(chǎn)生中和性抗體的主要抗原成份，可介導膜融合，引起血凝反應。張艷芳等[18]將乙型腦炎病毒prME及其信號肽基因片段克隆到穿梭載體AcBacmid中，構(gòu)建重組穿梭載體AcBac-prME。其轉(zhuǎn)染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒Ac-prME。Western-blotting、間接免疫熒光試驗及電鏡觀察，證實Ac-prME介導prME在Sf9細胞中高效表達，且形成了病毒樣顆粒。小鼠免疫和攻毒試驗表明，該病毒樣顆粒免疫可以使小鼠獲得有效抵抗乙型腦炎病毒強毒株攻擊的能力，保護率高達100%。

2.5 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的母豬繁殖障礙性疾病，臨床表現(xiàn)主要為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎，妊娠母豬的后期流產(chǎn)，流產(chǎn)率可達30%以上，小豬的死亡率在35%～40%。PRRSV可經(jīng)口腔、鼻腔、肌肉及生殖道等多種途徑感染豬發(fā)病。王璐等[19]為構(gòu)建高致病性PRRSV(HP-PRRSV)VLPs疫 苗， 以HP-PRRSV CQ株的GP5和M蛋白的全部編碼基因為模板，利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)能夠成功地共表達重組質(zhì)粒pFastBac1-GP5-M的GP5蛋白和M蛋白，并能自動裝配成VLPs，電鏡觀察到VLPs的直徑約為50 nm，該VLPs與天然蛋白類似的免疫原性。呂鳳林等[20]公開了一種PRRSV VLPs的研究方法。該疫苗是由PRRSV GP5、M、N3種蛋白構(gòu)成的VLPs，動物試驗結(jié)果表明，形成的VLPs加入或不加入佐劑制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型，免疫不同時期的豬群都能夠安全有效地預防PRRSV感染。Nam等[21]利用桿狀病毒表達載體，在Sf9昆蟲細胞中同時表達GP5和M蛋白，成功制備出PRRSV VLPs，用蔗糖梯度離心方法對其進行純化，并用不同量(0.5μg、1.0μ g、2.0μ g、4.0μ g)純化后的蛋白混合弗氏佐劑免疫小鼠，檢測血清抗體效價和細胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ水平，結(jié)果顯示，該疫苗可以有效引起機體的細胞免疫和體液免疫，其中GP5抗體效價顯著高于陰性對照，免疫4.0μ g劑量的IFN-γ水平顯著高于陽性對照，但陽性對照的IL-4、IL-10細胞因子水平高于試驗組，同時僅在免疫2.0μ g和4.0μ g VLPs的小鼠體內(nèi)檢測到中和抗體水平。

2.6 豬瘟

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，其發(fā)病率和死亡率均高，對養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴重。范京惠等[22]構(gòu)建了含CSFV的優(yōu)勢T細胞表位E290和PPV VP2基因的重組PM-VP2-E290，與Bac-N-BlueDNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9，獲得重組桿狀病毒將傳3代的重組桿狀病毒接種于形成50%單層的sf9細胞，應用免疫電鏡對表達產(chǎn)物進行觀察，可見到許多VLPs，表明目的基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中得到了表達，且表達的蛋白能自我裝配成VLPs，大量表達VLPs后，在無佐劑參與的情況下，按確定的免疫程序免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，檢測小鼠的細胞免疫和體液免疫學指標。結(jié)果表明，該VLPs不僅能誘導小鼠機體產(chǎn)生抗CSFV的特異性CTL反應，還能刺激小鼠產(chǎn)生抗PPV的特異性中和抗體。

2.7 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征高度傳染性疾病，各種不同品種和日齡的豬都能感染，2周齡受到的危害最為嚴重，死亡率可高達100%。冷勇等[23]構(gòu)建了含TGEV M和sM結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-M-sM，將重組桿狀病毒rBac-M和rBac-M-sM分別感染sf9昆蟲細胞，進行VLPs的體外組裝試驗。結(jié)果表明，M蛋白在sf9細胞內(nèi)單獨表達，M蛋白和sM在sf9細胞內(nèi)共同表達，都可形成TGEV VLPs，而且病毒粒子大小不等，直徑在61～101 nm。

2.8 豬流感

豬流感(SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。各種日齡和品種的豬均易感，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[24]。在我國豬群中流行的血清型主要是H1N1、H1N2和H3N2。Quan等[25]用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了H1N1流感病毒血凝素和基質(zhì)蛋自，共同感染昆蟲細胞后形成VLPs。用該VLPs肌注免疫小鼠，僅免疫一次，即可誘導小鼠產(chǎn)生以IgG2a為主的抗體反應，并且產(chǎn)生很高的血凝抑制滴度和記憶性IgG和IgA反應，更重要的是低劑量的VLPs就可產(chǎn)生抵抗致死劑量病毒感染的保護作用。

3 小結(jié)與展望

VLPs作為一種新型亞單位疫苗，具有多種優(yōu)點，不含有病毒核酸，不具有感染性，能模擬天然的病毒粒子，易被免疫系統(tǒng)識別，不需要佐劑，低劑量免疫后就能刺激機體產(chǎn)生良好的免疫應答發(fā)應，因此，在某此程度上，有替代傳統(tǒng)的疫苗的潛力，在動物疾病的防治方面有廣闊的應用前景。但在VLPs的研制過程中也存在一些問題，首先，VLPs疫苗的設計、表達、組裝及純化等對技術條件要求比較高，而且不是所有病毒都能組裝成VLPs。其次，當組裝多種蛋白形成的病毒樣粒子時，各個基因表達量的比例難以控制，表達不同蛋白的載體進入同一細胞的幾率小，產(chǎn)生VLPs的幾率相對降低，建立多基因共表達載體的難度大。另外，某些蛋白可能對細胞具有毒性，使其表達量較低，甚至引起其他蛋白的表達量降低，從而導致VLPs裝配效率的下降。再次，如何有效放大工藝水平，提高VLPs的組裝效率，降低成本等方面也存在著諸多挑戰(zhàn)。最后，VLPs采用不同的免疫途徑，其免疫效果不同，需要對不同的VLPs的免疫途徑進行研究，找出最佳的免疫途徑。發(fā)展多樣的VLPs疫苗將是一個趨勢。VLPs作為一項新興的技術，在新型豬病疫苗的研制中代表了一種非常有前途的研究方向，相信通過各國專家學者的共同努力，不久的將來VLPs疫苗必將為豬病毒病的防控提供新的技術手段。

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