李世鳳,吳得瑞

(甘肅省民樂(lè)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，734500)

淺析影響口蹄疫O型液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)的因素

李世鳳,吳得瑞

(甘肅省民樂(lè)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，734500)

液相阻斷ELISA，是檢測(cè)口蹄疫病毒抗體的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，敏感性高，特異性強(qiáng)，判定結(jié)果客觀，主要用于檢測(cè)抗體，評(píng)價(jià)FMD疫苗的免疫效力，也就是疫苗免疫動(dòng)物的抗強(qiáng)毒攻擊能力。目前，民樂(lè)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心廣泛采用ELISA法檢測(cè)口蹄疫免疫抗體，評(píng)價(jià)免疫效果，為全縣動(dòng)物疫情預(yù)警提供有效依據(jù)。

1 ELISA實(shí)驗(yàn)基本原理

ELISA是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù),過(guò)程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體（抗原）,再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）-待測(cè)抗體（抗原）-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 器材準(zhǔn)備：口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(伯騰ELX800)；洗板機(jī)(伯騰ELX50)；水質(zhì)要求：無(wú)離子水或者蒸餾水均可。

2.2 操作步驟

2.2.1 抗原抗體反應(yīng)稀釋血清；加病毒抗原：封板，震蕩，37℃溫育90分鐘；移板，封板，37℃溫育60分鐘；洗板，加豚鼠抗體工作液，37℃溫育30分鐘；洗板，加兔抗豚鼠IgG-HRp工作液，37℃溫育30分鐘；洗板，加底物溶液，37℃溫育15分鐘，再加終止液終止反應(yīng)，讀取D490nm。

2.3 結(jié)果判定

2.3.1 試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)：病毒抗原對(duì)照D490nm值應(yīng)該在1.5±0.5范圍內(nèi)。陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在1∶1024±1滴度以內(nèi)，陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)應(yīng)＜1∶8。

2.3.2 抗體效價(jià)的判定：被檢血清D490nm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于臨界值的孔為陽(yáng)性孔。

2.3.3 結(jié)果判定：抗體效價(jià)大于或者等于1∶128判為抗體陽(yáng)性；1∶64～1∶128時(shí)，判為可疑；小于1∶64，判為陰性。可疑血清樣品，重測(cè)抗體效價(jià)大于或者等于1∶128，判為陽(yáng)性，小于1∶128，判為陰性。

3 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素及改進(jìn)措施

3.1 貯藏。試劑盒應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書存放。（病毒抗原-20℃存放，其他成分2℃-8℃存放。）

3.2 回溫。試劑盒在使用前應(yīng)于室溫下充分回溫（時(shí)間30分鐘為宜）?；販剡^(guò)程中勿將酶標(biāo)板的包裝袋開封，回溫結(jié)束后再將其從包裝袋中取出使用。不同廠家的試劑盒不能混用，同一廠家不同批次的試劑盒也不能混用。被檢血清需緩慢升至室溫，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清樣品應(yīng)先離心或者過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。

3.3 相關(guān)試劑的配制

PBST洗滌液現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量用新鮮的不要多配制，底物溶液應(yīng)主要避光保存，臨用5分鐘內(nèi)加入雙氧水。熟悉移液器的使用，加樣時(shí)應(yīng)加在孔底部，避免加在孔壁上部，并且注意不可濺出。加樣時(shí)不可觸及酶標(biāo)板底部，以免吸附板底的反應(yīng)結(jié)合物脫落。加樣后及時(shí)放入恒溫箱，樣本較多時(shí)，要分批操作。每次加樣最好在2-3分鐘內(nèi)完成。每次加樣完進(jìn)行計(jì)時(shí)。

3.4 樣品稀釋。樣品稀釋應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。

3.5 溫育時(shí)一定要貼封膜，否則容易造成標(biāo)本或者稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于徹底清洗。反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。

3.6 樣品溫育時(shí)間結(jié)束后，馬上甩去孔內(nèi)液體。如多塊酶標(biāo)板需同時(shí)洗滌，可先將板內(nèi)液體甩去，倒扣于吸水紙（選擇無(wú)或者少塵的吸水材料）上，再依次進(jìn)行洗滌。使用洗板機(jī)洗滌時(shí)，建議洗滌次數(shù)增加一次。采用自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí)，洗液要加足（300微升），保證洗板針暢通。

3.7 提前打開酶標(biāo)儀，加入終止液后立即讀數(shù)。誤差是由很多細(xì)節(jié)造成的，減少誤差的方法有很多，比如做實(shí)驗(yàn)時(shí)少說(shuō)話，防止唾液掉進(jìn)酶標(biāo)條中；加樣時(shí)，由低濃度向高濃度加，這樣減少跳孔的幾率；勤換槍頭?？傊畠?yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是做好ELISA實(shí)驗(yàn)的必要條件。在實(shí)際操作中必須嚴(yán)格按照規(guī)定操作，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度檢測(cè)每一份待檢樣品，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

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1003-8655（2017）01-0072-01