王廣龍，王皓然，王勇，王釗哲，戴健濤，王曉楓，徐家付，姜夢，白文順，楊亮宇，汪善榮

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201**云南農(nóng)村干部學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)大科技生物公司劍川分公司，云南劍川671300；3.曲靖市宣威龍?zhí)舵?zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南曲靖655417）

ELISA檢測方法在禽白血病凈化中的應(yīng)用

王廣龍1，王皓然2，王勇3，王釗哲1，戴健濤1，王曉楓1，徐家付1，姜夢1，白文順1，楊亮宇1，汪善榮**

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201**云南農(nóng)村干部學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)大科技生物公司劍川分公司，云南劍川671300；3.曲靖市宣威龍?zhí)舵?zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南曲靖655417）

禽白血?。ˋvian Leukosis，AL）是由反轉(zhuǎn)錄病毒科α腫瘤病毒屬禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，感染率高，發(fā)病率低，是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一。禽白血病對(duì)種雞群的危害巨大，且目前尚無商品化疫苗，只能依靠對(duì)種雞群的凈化進(jìn)行防控。至今人類還不能有效的預(yù)防和治療本病，控制禽白血病的主要方法是通過病原檢測，淘汰陽性雞，凈化種群。國內(nèi)外相繼建立了多種檢測禽白血病的方法，其中ELISA法能高效的檢測到蛋清中的ALV抗原，具有敏感、簡便、快捷、適用于大面積檢測的特點(diǎn)，在種群凈化中得到了廣泛的應(yīng)用，但ELISA診斷試劑盒在我國還未實(shí)現(xiàn)商品化。在未來禽白血病的凈化將通過ELISA檢測方法來實(shí)現(xiàn)。

禽白血??；病原學(xué)；檢測方法；凈化；研究進(jìn)展

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的一種免疫抑制性腫瘤病。ALV的自然宿主主要是雞，其發(fā)病率和死亡率都較低，但是雞群感染ALV后會(huì)造成生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)來帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失；目前，防控AL的方法是對(duì)雞群進(jìn)行凈化。有關(guān)本病危害的研究報(bào)道可追溯到十九世紀(jì)末期，盡管養(yǎng)雞者已意識(shí)到禽白血病的危害，但由于這種病流行所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失相對(duì)較小，所以常被人們忽視。直到1997和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)大爆發(fā)，除澳大利亞和新西蘭外，世界各國都不同程度地遭受了J型白血病的襲擊，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前還沒有用于預(yù)防和治療AL的有效疫苗和藥物，國外的做法是對(duì)育種核心雞群進(jìn)行ALV的檢測、蹄選并淘汰陽性雞只，以達(dá)到凈化ALV的目的。在ALV-J發(fā)現(xiàn)之前，國外的凈化方法是成功的。我國近幾年對(duì)AL的防控也借鑒了國外的方法，一些品種的凈化也取得了明顯的效果[2]。在進(jìn)行凈化的同時(shí)，行業(yè)內(nèi)的研宄人員也在進(jìn)行相關(guān)的研究，如針對(duì)本地雞群的凈化方法的優(yōu)化，ALV檢測試劑盒和疫的研發(fā)發(fā)，ALV的分離鑒定及其序列測定等，通過這些相關(guān)研宄取得的結(jié)果,更好的指導(dǎo)凈化工作。目前，國際上檢測禽白血病病毒抗原最為理想的檢測方法是ELISA法[3]，它具有敏感高、簡便快捷、適用于大規(guī)模檢測的特點(diǎn)。1979年以來,禽白血病的ELISA診斷試劑盒在國外已實(shí)現(xiàn)商品化，但至今ELISA診斷試劑盒在我國還未實(shí)現(xiàn)商品化。這就給我國大、中型雞場凈化白血病帶來了極大困難，尤其近年來，我國陸續(xù)培養(yǎng)建立了數(shù)家SPF雞場，今后還會(huì)不斷增加，對(duì)SPF雞群AL/SV-gs抗原檢查目前主要依靠進(jìn)口試劑盒，不僅價(jià)格昂貴而且不方便。因此，研制較先進(jìn)的國產(chǎn)試劑盒是我們當(dāng)前急需要解決的問題。

1 ELISA檢測方法

1979年，Smith等[12]用CuHCl裂解法提純了p27蛋白，并用純化的p27免疫家兔，獲得兔抗p27高免血清(R12)，并建立了檢測雞白血病病毒抗原的雙抗體夾心ELISA，具有敏感、高效、簡便、快捷及適用于大面積檢測的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是同時(shí)檢測到內(nèi)源性ALV病毒，常使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。但研究表明蛋清中由于內(nèi)源性ALV的ELISA反應(yīng)假陽性結(jié)果很少，不足以影響禽白血病的檢測，因此可作為理想的檢測材料。1983年，L.N. Payne等應(yīng)用ELISA方法對(duì)雞群進(jìn)行檢測，隨后（1985）美國研制成ELISA試劑盒并于市場出售。國內(nèi)張晶等（1991）建立了檢測ALV抗原的Dot-ELISA和雙抗體夾心ELISA法，這兩種方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。秦愛建等(1999)用單克隆抗體建立的夾心ELISA也具有很高的特異性，這種方法適用于大批量樣品的檢測。陳晨等(2005)利用原核表達(dá)的禽白血病病毒(ALV)p27蛋白作為抗原制備的單抗作為包被抗體，以制得的兔抗p27作為酶標(biāo)抗體，建立了檢測ALV抗原的雙抗體夾心ELISA方法，該方法對(duì)禽白血病p27抗原的最小檢出量為5ng/mL。葉建強(qiáng)等利用抗J亞群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜蛋白特異性單克隆抗體JE9，建立了檢測ALV-J env抗原抗體免疫復(fù)合物的ELISA方法，具有快速、簡便及適合大規(guī)模檢測等特點(diǎn)。ELISA操作簡便，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，耗時(shí)較短，可作為一種有效的普檢方法，定期對(duì)種禽群進(jìn)行ALV檢測和凈化。ELISA的抗原檢測較抗體檢測在實(shí)際中應(yīng)用廣。ELISA法一般不用于本病的確診，臨床上有一定假陽性率出現(xiàn)，但是對(duì)監(jiān)測雞群的感染程度，建立無白血病的雞群則是必不可少的手段。ELISA還可用于檢測外源性ALV感染后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體。

2 禽白血病凈化方案

根據(jù)以上的檢測方法，我們對(duì)核心育種雞群禽白血病凈化的方案主要有三種。

第一種方案是美國喬治亞大學(xué)禽病診斷和研究中心正在使用的方案，也是國際上通用的金標(biāo)準(zhǔn)；該方案以病毒分離技術(shù)為主要手段，具體程序是,在68日齡和168日齡時(shí)采集，核心雞群的血漿，接種到DF-1細(xì)胞上，維持培養(yǎng)9天后檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALVp27抗原，陽性淘汰，陰性留種，并釆集留種核心雞群的下一代1日齡雛雞的胎糞,檢測其中的p27抗原,陽性淘汰。該方案的優(yōu)點(diǎn)是排除了內(nèi)源性ALV干擾而產(chǎn)生的假陽性樣品,并且重復(fù)多次，大大降低了漏檢的機(jī)率,因此準(zhǔn)確性很高;缺點(diǎn)是檢測時(shí)間長,成本高,過程繁瑣,不易操作。

第二種方案以ELISA檢測技術(shù)為主要手段，具體程序是，在18～43周齡之間，多次(至少兩次)采集核心雞群公、母的泄殖腔棉拭子或蛋清，用ELISA的方法檢測其中的p27抗原，并檢測它們下一代最初艘化的兩只雛雞的胎糞中的p27抗原，陽性淘汰。該方案適用于整個(gè)后備育種核心雞群p27陽性率低于20%或是育種專家可接受的淘汰范圍內(nèi)的情況。優(yōu)點(diǎn)是方法簡單，成本低，容易操作，凈化速度較快；缺點(diǎn)是無法排除內(nèi)源性病毒的干擾，增加了淘汰率，在陽性率高的情況下，增加了生產(chǎn)成本,不利于的選種。

第三種方案以ELISA檢測技術(shù)和病毒分離技術(shù)相結(jié)合為主要手段,具體程序是，在禽白血病流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，選定一個(gè)比較適合的年齡，采集育種核心雞群的泄殖腔棉拭子或蛋清，進(jìn)行ALVp27抗原檢測,然后將陽性與陰性雞分開詞養(yǎng)，采集陽性雞的血清或蛋清接種DF-1細(xì)胞,維持培養(yǎng)9天后檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的p27抗原，陽性淘汰，陰性留種。該方案的優(yōu)點(diǎn)是將EL1SA檢測技術(shù)和病毒分離技術(shù)相結(jié)合,互相彌補(bǔ)了采用單一檢測技術(shù)的一些不足,在檢測時(shí)間上得到緩沖，又排除了內(nèi)源性病毒的干擾，僅淘汰外源性ALV陽性的雞只；缺點(diǎn)是增加了一道鑒別內(nèi)外源性ALV的檢測技術(shù)，操作難度和檢測成本較第二種方案都有所提高。該方案比較適用于采用ELISA檢測技術(shù)時(shí),后備育種雞群p27陽性率高于20%的情況。

3 小結(jié)

禽白血病的凈化是一個(gè)長期的過程，需要經(jīng)過幾個(gè)世代的凈化才能徹底根除這個(gè)病，在飼養(yǎng)管理和預(yù)防條件上改進(jìn)，我國的地方品種雞的白血病將徹底根除。

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S854.4

B

1003-8655（2017）01-0067-02

王廣龍（1991—），男，漢族，海南?？谌耍T士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床診斷研究，E-mail：937395968@qq.com

**通訊作者：汪善榮（1967—），男，安徽壽縣人，碩士，副編審，主要從事農(nóng)業(yè)資源研究。