任志欣 李東霞 楊麗敏

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

蒙藥大花葵對白色念珠菌的試驗研究

任志欣1李東霞2楊麗敏3

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

目的：觀察大花葵的水提物及醇提物對白色念珠菌的體外抑菌試驗研究，并觀察經(jīng)大花葵水提物作用后白色念珠菌的超微結(jié)構(gòu)改變。方法：分別制備大花葵的水、醇提物，采用SDA培養(yǎng)基，應(yīng)用液態(tài)稀釋法進行體外藥敏試驗的研究，并對經(jīng)藥物作用前后的白色念珠菌進行掃描電鏡觀察。結(jié)果：大花葵水、醇提物對白色念珠菌的MIC值分別為50mg/mL和100mg/mL，掃描電鏡下觀察顯示，經(jīng)大花葵水提物作用后的白色念珠菌有較明顯的結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論：通過本試驗明確了蒙藥對白色念珠菌有較突出的抑制作用，在為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)的同時，也為此類疾病的治療提供新的可供選擇的方法，有待于我們進一步深入研究。

蒙藥；白色念珠菌；試驗研究

白色念珠菌是最常見的條件致病菌，在檢出的致病性真菌中占首位[1-2]。目前抗此類真菌的藥物種類繁多，但副作用大，且容易復(fù)發(fā)。因此，具有抗真菌作用的中藥及民族藥作為純天然、無污染藥物，具有價格低廉，毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性等特點越來越受到人們的關(guān)注。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上[3]，篩選蒙藥大花葵( Malva sylvestris?)，即占巴其其格的水提物和醇提物對白色念珠菌進行體外抑菌實驗研究，以找出其有效的活性成分，為抗真菌蒙藥的研發(fā)提供一些新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：菌種，白色念珠菌(Candida. Albicams.編號ATCC-11006)由北大醫(yī)院真菌實驗中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株。實驗用蒙藥大花葵來自內(nèi)蒙古中醫(yī)藥研究所。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基：沙堡弱培養(yǎng)基(Sabouraud dextroseagar SDA)，成分為麥芽糖 4g、蛋白胨1g、瓊脂2g、蒸餾水100mL。將上述成分按照一定比例混合后，加熱充分溶解，121℃,15min高壓滅菌。

1.2.2 藥物提?。簩⒋蠡鬯槌纱址邸Ｋ崛》?，取100g藥物置于不銹鋼鍋中，加10倍蒸餾水1000mL侵泡4h后與加石棉網(wǎng)的電爐上加熱煎煮1h，絹布過濾，濾出煎液，藥渣再加5倍蒸餾水500mL,同時浸泡、煎煮、過濾，將2次濾液混合，加熱濃縮至小體積，超濾膜過濾，采用真空干燥箱70減壓干燥36h得藥材水提物。乙醇提取法：取大花葵粗粉100g置于圓底燒瓶中，加入10倍量95%醫(yī)用乙醇1000mL，浸泡4h后回流提取1h，絹布過濾，濾出乙醇液，藥渣再加5倍量95%醫(yī)用乙醇500mL，提取同上法相同。將2次乙醇液混合，加熱濃縮至小體積，超濾膜過濾，減壓回收乙醇至小體積，在水浴鍋上繼續(xù)濃縮成流浸膏，采用真空干燥箱70減壓干燥36h得藥材醇提取物。

最后將提取物烘干箱內(nèi)烘干后制成細粉劑。

1.3 抑菌試驗

1.3.1 受試菌活化：白色念珠菌接種于平皿內(nèi)的SDA培養(yǎng)基，于36℃溫箱培養(yǎng)48h，培養(yǎng)二代后的新鮮菌落備用。

1.3.2 液態(tài)培養(yǎng)基稀釋法(倍比稀釋法)：將大花葵的水提物和醇提物各稱0.5g,分別溶于2.5mL液態(tài)沙堡弱培養(yǎng)基(不加蛋白胨)，按倍比稀釋法將其在無菌操作臺稀釋為100g/L，50g/L， 25g/L，12.5g/L和6.25g/L5個濃度。

用生理鹽水洗下平皿內(nèi)培養(yǎng)的新鮮菌落入試管(在無菌操作臺操作)，并將洗下的菌落取0.1mL加入4.9mL生理鹽水中，再用比濁管比濁，標(biāo)準(zhǔn)管為0.045×108/mL(即原液中菌落數(shù)為4500000個/mL)，將其用生理鹽水稀釋后為10000個/mL。用吸量管吸取已制備好的菌液0.1mL分別加入不同濃度藥液中(即每毫升藥液中含菌落1000個)，后放入36～37溫箱中培養(yǎng)48h后，將藥液在酒精燈下從試管中分別倒入已備好的固體SDA培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，再放入36～37溫箱中培養(yǎng)同樣時間后觀察。以上試驗選取空白對照組(未加藥物接種菌懸液的培養(yǎng)基)為陽性對照，不含藥物和菌懸液的純培養(yǎng)基為陰性對照。

1.3.3 結(jié)果判定：該藥水、醇提物抑菌試驗均重復(fù)3次，取重復(fù)值或中間值，無菌落生長的平皿內(nèi)藥物濃度即為該藥對此菌的最小抑菌濃度(即MIC值)。

1.4 掃描電子顯微鏡下觀察：濃度為50g/L的大花葵水提物放入已活化的白色念珠菌液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后，用無菌蒸餾水離心2次，倒掉上清液，加2.5%的戊二醛固定，后放入4冰箱內(nèi)24h。然后PBS液沖洗、離心3次，50%、70%、95%、100%梯度酒精脫水。將放在100%酒精中的標(biāo)本同酒精同放在4℃冰箱中凍結(jié)成固體。再用抽濾瓶于真空條件下干燥、噴金，在S-530型掃描電子顯微鏡下觀察藥物作用前后白色念珠菌的形態(tài)改變。(以上電鏡部分在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡中心完成)

2 結(jié)果

2.1 MIC抑菌濃度測定：濃度為100mg/mL的醇提物及濃度為50mg/mL的水提物與空白對照組相比對白色念珠菌有抑制作用，即MIC值分別為100mg/mL和50mg/mL。

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果：未經(jīng)藥物作用的白色念珠菌呈卵圓形，有出芽，菌體表面光滑、無皺褶；經(jīng)藥物作用后的菌體表面結(jié)構(gòu)有明顯變化，分生孢子的細胞壁粗糙、出現(xiàn)凹陷、甚至外層剝落，可見菌體球狀膨大、皺縮、不規(guī)則，且破壞后的菌落成堆出現(xiàn)，有的菌體有缺口、壓跡尾巴，菌絲變短變粗，甚至塌陷、剝脫。

3 討論

近年來，隨著免疫抑制劑，廣譜抗生素和抗腫瘤藥物等的廣泛應(yīng)用，臨床常見的真菌性皮膚病有不斷上升的趨勢，且此類疾病的高發(fā)病率，高復(fù)發(fā)率已伴隨經(jīng)濟的發(fā)展和社會的進步而日益受到醫(yī)患雙方的重視。蒙醫(yī)藥是祖國醫(yī)藥學(xué)的一塊瑰寶，是蒙古民族的珍貴遺產(chǎn)。蒙藥的化學(xué)成分比較復(fù)雜，本試驗選用醇提和水提兩種方式，了解同一藥用2種不同方法提取后抗白色念珠菌方面的差異

本試驗選用大花葵水、醇提物對白色念珠菌進行體外抑菌試驗，結(jié)果表明：大花葵水提物MIC值為50mg/mL，醇提物為100mg/mL。掃描電子顯微鏡下大花葵水提物對白色念珠菌有破壞作用，使菌絲彎曲，腫脹。由此進一步證實大花葵水提物對白色念珠菌有抑制作用。通過本試驗，可以為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)的同時也為此類疾病的治療提供新的可供選擇的方法。

[1].李莉，蘇天璐，苗翠，等.白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的耐藥性分析[J].中國實驗診斷學(xué)，2011,15(1):126～128.

[2]江園萍，章強強，李莉.328株真菌病原菌分析[J].皮膚病與性病，2012,34(4)：214～215.

[3]包德畢歷格，陳德珍，秦效勇，等.60種蒙藥試管內(nèi)抑制真菌作用的初步實驗研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，1991,5(2)：80～82

2016年8月10日收稿

R291.2

A

1006-6810(2017)02-0068-02