劉世晶， 王 帥， 唐 榮， 陳 軍， 劉興國(guó)， 周海燕

( 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海 200092)

基于熒光效應(yīng)和調(diào)色板均衡化的小球藻自動(dòng)計(jì)數(shù)方法研究

劉世晶， 王 帥， 唐 榮， 陳 軍， 劉興國(guó)， 周海燕

( 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海 200092)

為實(shí)現(xiàn)藻類的自動(dòng)計(jì)數(shù)，以小球藻為對(duì)象，提出一種基于熒光效應(yīng)和調(diào)色板均衡化的小球藻自動(dòng)計(jì)數(shù)方法。首先對(duì)小球藻熒光顯微圖像進(jìn)行預(yù)處理，將真彩色小球藻熒光圖像轉(zhuǎn)換為256色圖像，再采用調(diào)色板均衡化算法增強(qiáng)小球藻熒光圖像對(duì)比度，并利用基于調(diào)色板的閾值分割算法將目標(biāo)藻類與背景進(jìn)行分割，同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，該計(jì)數(shù)方法能夠避免雜質(zhì)影響，直接對(duì)藻類彩色圖像進(jìn)行圖像增強(qiáng)和閾值分割，可以增強(qiáng)圖像對(duì)比度，避免彩色圖像灰度化過程中圖像信息損失；采用連通區(qū)域標(biāo)記方法結(jié)合連通區(qū)域的大小識(shí)別低重疊度藻類，可降低重疊藻類對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，從而提高小球藻的計(jì)算準(zhǔn)確度。研究表明，該方法實(shí)現(xiàn)了針對(duì)藻類彩色圖像的自動(dòng)計(jì)數(shù)，且對(duì)小球藻的計(jì)數(shù)精度準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上，高于只使用灰度圖像計(jì)數(shù)的方法。

均衡化；閾值分割；熒光；計(jì)數(shù)

小球藻(Chlorella)是一種高效的光合藻類。計(jì)算小球藻的數(shù)量在監(jiān)測(cè)池塘、湖泊、水庫等水體的水質(zhì)狀況時(shí)起著極其重要的作用[1-2]。隨著機(jī)器視覺技術(shù)、圖像處理技術(shù)的發(fā)展，利用熒光方法[3-4]和圖像處理方法[5-8]進(jìn)行動(dòng)植物識(shí)別、品質(zhì)檢測(cè)、行為研究等技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，并在藻類檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用[9-12]。Jukka等[13]根據(jù)一定浮游植物主要輔助色素在特定波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)浮游植物門類的快速化學(xué)分類；Beutler等[14]利用浮游植物的葉綠素?zé)晒夤庾V的不同特性，將浮游植物分為四大類進(jìn)行識(shí)別。上述兩種方法能夠很好地鑒別藻類的門類，但很難實(shí)現(xiàn)藻類的精確計(jì)數(shù)。Peeh-Pacheeo等[15]應(yīng)用圖像捕捉處理方法對(duì)5種角藻進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù)，該方法具有較好的分類和計(jì)數(shù)精度，但對(duì)具有相同外形的雜質(zhì)識(shí)別度較差；另有一個(gè)將熒光分析與圖像分析相結(jié)合的赤潮生物檢測(cè)系統(tǒng)[16]，利用熒光圖像和灰度圖像的圖像特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)藻類識(shí)別和計(jì)數(shù)，但圖像處理主要依賴灰度圖像，實(shí)際應(yīng)用中容易丟失彩色圖像中的有效信息，降低檢測(cè)精度。

目前，尚未見到直接利用藻類熒光彩色圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。為了降低彩色圖像灰度化過程中圖像有效信息的損失、提高藻類計(jì)數(shù)精度，提出了一種基于調(diào)色板均衡化小球藻計(jì)數(shù)方法，在不進(jìn)行圖像灰度化的情況下實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)采用單一小球藻試驗(yàn)液，密度為600萬個(gè)/mL。顯微鏡選擇奧林巴斯BX51，配套熒光光源，觀察倍數(shù)40×10。相機(jī)采用顯微鏡配套的DP71彩色CCD顯微攝像機(jī)。利用分光光度計(jì)測(cè)量小球藻吸收光譜曲線，得到小球藻的吸收波峰在650 nm附近。根據(jù)小球藻的光譜特性，入射光源處選擇中心波長(zhǎng)420 nm、半波寬10 nm、透射率大于 50%的濾色片，接收口選擇 680 nm 的高通濾色片，入射光源選取 40～50 W 的冷光源燈。計(jì)算機(jī)CPU主頻為2.7 G，2 G內(nèi)存，1 G顯存。實(shí)驗(yàn)軟件利用VC++6.0開發(fā)，基于XP系統(tǒng)。

采集圖像為RGB格式，以256色BMP圖像格式存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)中。藻類圖像如圖1所示。

圖1 小球藻熒光激發(fā)圖像Fig.1 Image of chlorella fluorescence excitation

2 圖像處理

2.1 圖像調(diào)色板均衡化

利用式(1)[17]統(tǒng)計(jì)256色的小球藻顯微熒光圖像調(diào)色板中各顏色在圖像中的概率密度函數(shù)。

(1)

式中：n—圖像總像素?cái)?shù)，pixels；Ci—?dú)w一化后不同顏色的色階，級(jí)；ni—在圖像中出現(xiàn)第L級(jí)灰度的次數(shù)，次；SL—處理后圖像的歸一化色階，級(jí)；T(CL) —概率密度函數(shù)變換關(guān)系式；Pc(Ci)—為取第k級(jí)灰度值的概率。

利用公式(2)的變換關(guān)系均衡圖像調(diào)色板中顏色，得到如圖2所示圖像。

CL=[(M-1)SL]

(2)

式中：L=0，1，…，n；M—圖像中可能的灰度級(jí)總數(shù)，級(jí)；M-1—處理后圖像的色級(jí)總數(shù)，級(jí)。

圖2 調(diào)色板均衡化后圖像Fig.2 Image after palette equalization

2.2 基于圖像調(diào)色板的閾值分割

(3)

處理后的圖像(圖2)，增加了目標(biāo)和背景的差異。調(diào)色板顏色直方圖分布情況如圖3所示。

圖3 顏色直方圖分布Fig.3 Color histogram distribution

紅色小球藻點(diǎn)集中在0閾值附近，藍(lán)色背景點(diǎn)集中在200和250閾值處，采用128處閾值作為固定閾值，閾值分割后的二值圖像如圖4所示。

圖4 閾值分割后圖像Fig.4 Image after threshold segmentation

2.3 藻類計(jì)數(shù)

分割后的圖像，目標(biāo)區(qū)域存在一些小的孤立點(diǎn)，因此利用開運(yùn)算結(jié)合閉運(yùn)算的方法，可以有效去除噪聲，各部分的處理效果如圖5所示。圖5(b)的噪聲點(diǎn)比圖5(a)有所減少，小球藻圖像更加清楚。對(duì)二值圖像進(jìn)行連通區(qū)域標(biāo)記，每完成一次標(biāo)記，記錄該區(qū)域外接矩形面積，設(shè)置矩形面積上限值，根據(jù)面積閾值將計(jì)算重疊藻類數(shù)量(圖6)，該算法能區(qū)分重疊部分較少的藻類圖像，提高計(jì)數(shù)精度。

圖5 各部分處理效果Fig.5 Treatment effect of each part

圖6 重疊小球藻計(jì)數(shù)流程Fig.6 Process of overlapping chlorella counting

3 結(jié)果與分析

采用本研究提出的小球藻自動(dòng)檢測(cè)和計(jì)數(shù)方法對(duì)20幅不同濃度的藻類圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。首先采用人工計(jì)數(shù)方法精確統(tǒng)計(jì)一副圖像中小球藻數(shù)量，以此為基準(zhǔn)分別比較本文方法與基于灰度圖像傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法[19-20]，測(cè)定自動(dòng)檢測(cè)和計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度，二者計(jì)數(shù)誤差如圖7所示?？梢钥闯觯跍y(cè)試的20幅小球藻圖像中，隨著藻類濃度的增加，計(jì)數(shù)結(jié)果的誤差逐漸增大。其中，使用本文算法在小球藻數(shù)量為75個(gè)以下時(shí)，誤差為1個(gè)及以下，傳統(tǒng)方法誤差為1～3個(gè)；之后，隨著小球藻數(shù)量的增多，2種方法的誤差都會(huì)相應(yīng)增加，本文方法的誤差增幅明顯小于傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法。因此，本文算法的誤差明顯低于采用灰度圖像計(jì)數(shù)的算法。

圖7 兩種算法計(jì)數(shù)結(jié)果誤差曲線Fig.7 Error curve of two kinds of algorithm counting results

基于壓片的藻類顯微圖像，由于光照、背景的不確定性，使得基于圖像的計(jì)數(shù)方法主要停留在實(shí)驗(yàn)室階段[21]。因此，本研究重點(diǎn)關(guān)注算法的魯棒性和準(zhǔn)確性。已有的研究成果，如對(duì)重疊的顆粒[22]、菌落[23]、粘連蠶卵[24]與粘連大米[25]進(jìn)行計(jì)數(shù)，雖然這些方法適用范圍廣、分割結(jié)果較好，但容易發(fā)生過分割與欠分割的情況。

基于熒光效應(yīng)和調(diào)色板均衡化的小球藻自動(dòng)計(jì)數(shù)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)能夠避免雜質(zhì)影響，直接對(duì)藻類彩色圖像進(jìn)行圖像增強(qiáng)和閾值分割，可增強(qiáng)圖像對(duì)比度，避免彩色圖像灰度化過程中圖像信息損失；(2)采用連通區(qū)域標(biāo)記方法結(jié)合連通區(qū)域的大小來識(shí)別低重疊度藻類，降低了重疊藻類對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，從而能夠提高小球藻的計(jì)算準(zhǔn)確度。由圖7可知，采用該算法還存在一定的偏差，主要有以下問題：(1)藻類壓片后存在分層現(xiàn)象，不同層面上的藻類熒光點(diǎn)在熒光圖像中光強(qiáng)存在明顯差異，甚至有些熒光點(diǎn)與背景之間的色度相當(dāng)接近，特別是當(dāng)藻類密度增加時(shí)分層現(xiàn)象更加明顯；(2)當(dāng)藻類數(shù)量增加時(shí)，出現(xiàn)藻類之間重疊的概率增大，雖然本文能夠?qū)Φ椭丿B度藻類進(jìn)行識(shí)別，但當(dāng)重疊度較高時(shí)，識(shí)別難度較大，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差。

4 結(jié)論

提出了一種基于調(diào)色板均衡化小球藻計(jì)數(shù)方法，在不進(jìn)行圖像灰度化的情況下實(shí)現(xiàn)藻類準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，通過對(duì)20幅不同濃度的藻類圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：(1)該方法實(shí)現(xiàn)了針對(duì)藻類彩色圖像的自動(dòng)計(jì)數(shù)，且對(duì)小球藻的計(jì)數(shù)精度準(zhǔn)確率在95%以上，高于只使用灰度圖像計(jì)數(shù)的方法；(2)相較于彩色圖像灰度化的藻類識(shí)別與計(jì)數(shù)方法，本文方法能有效降低圖像特征損失，均衡后圖像目標(biāo)與背景對(duì)比度明顯增強(qiáng)；(3)該方法根據(jù)藻類熒光特性，利用均衡化算法直接處理256色圖像調(diào)色板，并采用連通區(qū)域標(biāo)記方法結(jié)合連通區(qū)域的大小來識(shí)別低重疊度藻類，降低了重疊藻類對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，提高了計(jì)數(shù)精度。藻類重疊度較高時(shí)，如何提取多特征、如何改進(jìn)算法來提高計(jì)數(shù)的精度，將是本文算法改進(jìn)的一個(gè)重要方面，也是下一步的研究方向。

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Study on automatic counting method of Chlorella vulgaris based on fluorescence effect and palette equalization

LIU Shijing，WANG Shuai，TANG Rong，CHEN Jun，LIU Xingguo，ZHOU Haiyan

(Fishery Machinery and Instrument Research Institute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200092,China)

In order to realize the automatic counting of algae, takingchlorella(Chlorellavulgaris) as the target, an automatic counting method based on fluorescence effect and palette equalization was proposed in this paper. Firstly, the fluorescent micrograph of chlorella was pretreated, by transforming it into 256-color images and enhancing its contrast by palette equalization algorithm. Then the target algae and the background were divided using threshold segmentation algorithm of the palette, and simultaneously counted. The results showed that this counting method could avoid the interference of impurities, directly realize the algae color image enhancement and threshold segmentation, increase the image contrast and avoid loss of image information during the process of color image graying; and by using the connected area marking method combined with the size of the connected region to recognize the algae of low overlapping degree, it reduced the influence of overlapping algae on the counting results, and thus could improve the calculation accuracy of chlorella. The experimental results show that this method can achieve automatic counting for algae color images, and the accuracy of chlorella counting accuracy is higher than 95%, which is higher than that of those methods using only gray scale image.

equalization; palette thresholding; fluorescence; count

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.06.003

2016-07-17

2016-10-10

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2014)第4-6-1號(hào))；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-47)

劉世晶(1982—)，男，助理研究員，碩士，研究方向：圖像處理和模式識(shí)別。E-mail：lsjing2003@163.com

S951

A

1007-9580(2016)06-012-05