費(fèi) 剛

（長(zhǎng)春生物制品研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062 ）

超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液細(xì)菌內(nèi)毒素的效果分析

費(fèi) 剛

（長(zhǎng)春生物制品研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062 ）

目的 利用超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液細(xì)菌內(nèi)毒素。方法 采用截留相對(duì)分子質(zhì)量30萬(wàn)的超濾膜對(duì)森林腦炎滅活疫苗原液進(jìn)行超濾，用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)超濾前后森林腦炎滅活疫苗原液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。結(jié)果 利用超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，將細(xì)菌內(nèi)毒素的清除效果進(jìn)行定量分析，細(xì)菌內(nèi)毒素去除率可達(dá)80.0%～94.0%。結(jié)論 采用截留相對(duì)分子質(zhì)量30萬(wàn)的超濾膜對(duì)森林腦炎滅活疫苗原液超濾中進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的清除方法效果理想。

森林腦炎疫苗；細(xì)菌內(nèi)毒素；超濾法；動(dòng)態(tài)濁度法

森林腦炎是由森林硬蜱傳染的一種疾病，疾病主要分布在我國(guó)東北地區(qū)的森林地帶，由硬蜱叮咬而感染森林腦炎病毒導(dǎo)致患病，稱森林腦炎病[1]。森林腦炎滅活疫苗可以預(yù)防森林腦炎疾病，在森林腦炎滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中利用超濾技術(shù)可以有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素是人體在醫(yī)療診治過(guò)程中產(chǎn)生發(fā)熱現(xiàn)象的物質(zhì)，極微量?jī)?nèi)毒素就能引起體溫上升、休克甚至死亡[2]。2010年版《中國(guó)藥典（第三部）》記載森林腦炎滅活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)不高于100 EU/mL（附錄XIIE凝膠限度試驗(yàn)）[3]。動(dòng)態(tài)濁度法可以定量測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素，測(cè)定范圍在0.006～300 EU/mL。此法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，但需要精密的專用儀器[4]。本人利用超濾法去除森林腦炎滅活疫苗原液超濾前后的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的變化，定性定量地檢測(cè)，系統(tǒng)地分析超濾技術(shù)除去細(xì)菌內(nèi)毒素的效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試藥

1.1 超濾設(shè)備：①超濾器廠家 Millipore 規(guī)格/型號(hào)CUF50；②細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀（BET-16M型）（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 森林腦炎疫苗原液：生產(chǎn)批號(hào) 20110605、20110806、20111009（長(zhǎng)春生物制品研究所提供）。

1.3 試劑：①細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)生物制品檢定所規(guī)格150 EU/Amp 批號(hào)2012-6）；②動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（ λ=0.03 EU/mL規(guī)格0.6 mL/Amp 批號(hào)0121201）；③細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（規(guī)格5 mL/Amp 批號(hào)0120102）；④細(xì)菌內(nèi)毒素指示劑（規(guī)格300 mL/Amp批號(hào)0120214）。試劑提供單位：湛江博康海洋生物有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定三批森林腦炎滅活疫苗原液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素去除效果見(jiàn)

2.2 將上述三批森林腦炎滅活疫苗原液的容器分別與超濾用滅菌的封閉系統(tǒng)相連接。 對(duì)疫苗原液進(jìn)行超濾，所用膜包截留分子量為300 kD，將三批超濾液封閉待檢。

2.3 用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定超濾后的三批森林腦炎滅活疫苗的細(xì)菌內(nèi)毒素含量量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

2.4.1 含量測(cè)定：細(xì)菌內(nèi)毒素去除率Q=（C前-C后）/C前×100%，C前和C后分別是藥液超濾前后細(xì)菌內(nèi)毒素的含量 EU/mL[5]。表1中顯示，三批原液經(jīng)超濾后細(xì)菌內(nèi)毒素大幅降低，去除細(xì)菌內(nèi)毒素效率達(dá)到80%～94%，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度在7.80～29.22 EU/mL，均在藥典規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)不高于100 EU/mL。超濾液檢定中效價(jià)測(cè)定、病毒滴定、無(wú)菌檢查、支原體檢查、抗原含量和蛋白含量均在要求范圍之內(nèi)。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和試驗(yàn)的可靠性驗(yàn)證：用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，配制成內(nèi)毒素濃度分別為2.0 EU/mL、0.5 EU/mL、0.125 EU/mL、0.03125 EU/mL的溶液。將含有0.1 mL鱟試劑溶液的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)分別加入0.1 mL的2.0 EU/mL、0.5 EU/mL、0.125 EU/mL、0.03125 EU/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，均勻混溶，利用檢測(cè)儀檢測(cè)，讀取數(shù)據(jù)。各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)3份，同時(shí)作陰性對(duì)照（NC ）標(biāo)準(zhǔn)溶液2份，結(jié)果見(jiàn)表2。利用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以最小二乘方法計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)為：回歸方程logT=3.160-0.321logC，相關(guān)系數(shù)r=-0.9991，濃度范圍0.03125 EU/mL～2.0 EU/mL。試驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的內(nèi)毒素在2～0.03125 EU/mL時(shí)，試驗(yàn)反應(yīng)可以控制在3600 s之內(nèi)，陰性對(duì)照符合標(biāo)準(zhǔn)要求，標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液0.03125 EU/mL也就是最小濃度反應(yīng)時(shí)間為3400 s小于陰性對(duì)照時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)可靠。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)可靠性

2.4.3 干擾實(shí)驗(yàn)與內(nèi)毒素測(cè)定：將三個(gè)批號(hào)的森林腦炎滅活疫苗超濾液分別稀釋600倍，各稀釋后的液體作為供試液（NPC），將0.5 EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入到各批號(hào)的供試液之中，制作陽(yáng)性對(duì)照（PPC）。將各批號(hào)溶液加入0.1 mL鱟試劑溶液，定量檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，各濃度要求檢測(cè)2份。計(jì)算回收率：R=（CPPC-CNPC）/ λm× 100%。式中CPPC ——樣品陽(yáng)性對(duì)照液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量EU/mL。CNPC——超濾后細(xì)菌內(nèi)毒素的含量EU/mL。λm——標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度，即0.5 EU/mL[6]。在試驗(yàn)過(guò)程中供試品溶液無(wú)干擾的前提是細(xì)菌內(nèi)毒素回收率必須在50%～200%，此試驗(yàn)的回收率在114.26%～137.40%[7]。此試驗(yàn)表明供試液在該濃度下對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用，結(jié)果符合規(guī)定。

3 討 論

采用截留相對(duì)分子質(zhì)量30萬(wàn)的超濾膜對(duì)森林腦炎滅活疫苗原液進(jìn)行超濾，去除森林腦炎滅活疫苗原液中細(xì)菌內(nèi)毒素效果可靠，去除率可達(dá)到94%，有效成分的透過(guò)率在合理范圍之內(nèi)。超濾方法去除森林腦炎滅活疫苗原液中細(xì)菌內(nèi)毒素效果是安全有效的，可以廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)之中。

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