成 瑜 李洪倫

1 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 煙臺(tái) 264000；2 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院影像中心

?

八寶丹處理肺腺癌細(xì)胞A549和SPCA-1對(duì)順鉑化療敏感性的影響*

成 瑜1李洪倫2

1 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 煙臺(tái) 264000；2 青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院影像中心

目的 探討八寶丹處理人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系對(duì)順鉑(DDP)抗腫瘤化療敏感性影響。方法 收集人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系進(jìn)行不同處理，隨機(jī)分為對(duì)照組(空白)、DDP組(4 uM)、(八寶丹+DDP)組(0.75 mg/kg+4 uM)，處理3周，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定(TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果 與對(duì)照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.001)。結(jié)論 (八寶丹+DDP)可以增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，降低腫瘤細(xì)胞的增殖，減少A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目，增加腫瘤細(xì)胞的DDP抗腫瘤敏感性。

肺腺癌；八寶丹；順鉑；化療敏感性

腫瘤目前仍是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織( WHO)統(tǒng)計(jì)，2008年全球有1240萬(wàn)人被新檢查出患有癌癥，760萬(wàn)人死于癌癥．順鉑是第一代鉑類抗腫瘤藥物，具有抗癌譜廣、作用機(jī)制獨(dú)特、利于臨床聯(lián)合用藥等特點(diǎn)．在臨床上順鉑對(duì)肺癌、胃癌、頭頸部腫瘤、骨肉瘤等實(shí)體腫瘤的治療取得了很好的效果[1-2]。但是順鉑在治療過(guò)程中具有副作用多、毒性大等缺點(diǎn)，因此尋找高效低毒的腫瘤化療增敏劑以增強(qiáng)順鉑的化療效果，提高患者的生存率是一項(xiàng)重要的課題。八寶丹具有清利濕熱、活血解毒、去黃止痛的功效，輔助抗菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[3-4]，長(zhǎng)期服用可以減輕化療藥物的毒副作用。而將其用于人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系對(duì)DDP化療敏感性的研究并不多見(jiàn)，本研究通過(guò)采用八寶丹處理人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系從而觀察八寶丹對(duì)DDP在肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系中化療作用的影響，證實(shí)八寶丹在抗腫瘤治療中能提高對(duì)DDP化療敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 A549細(xì)胞系，SPCA-1細(xì)胞(上海華瑞生物科技有限公提供)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板(NEST，Cat.No.PPP-001-030)；細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30087.01)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)，PBS磷酸鉀緩沖液(Hyclone，Cat.No.SH30256.01B)，DMSO，TUNEL BrightGreen Apoptosis Detection Kit(Vazyme，A112-02) ，DAPI(碧云天)。八寶丹膠囊(廈門中藥廠有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10940006，0.75 mg/kg)，順鉑(云南生物谷藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20043888，4 uM),其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 收集肺腺癌細(xì)胞A549和SPCA-1，根據(jù)處理的藥物不同，DDP單藥及八寶丹聯(lián)合DDP進(jìn)行處理，隨機(jī)分為對(duì)照組(空白)、DDP組(4 uM)、(八寶丹+DDP)組(0.75 mg/kg+4 uM)，分別進(jìn)行相應(yīng)的處理。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific生產(chǎn)，型號(hào)：multiscan MK3)；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo HERACELL150i)；倒置生物顯微鏡(OPTEC BDS200-PH)；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning 3422)；倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41,U-CTR30-2)；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo scientific, HERACELL150i)。

1.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力[5]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL個(gè)細(xì)胞，加入100 uL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基細(xì)胞懸液，加入Transwell小室上室，在下室加入600 uL完全培養(yǎng)基。在37℃,5%CO2孵育24小時(shí)后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌一次，結(jié)晶紫染色10min，PBS洗滌一次，檢測(cè)細(xì)胞是否穿過(guò)小孔，如有穿過(guò)終止其他實(shí)驗(yàn)組，并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力[6]取同一批分離的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，接種于24孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。按1.2和1.3方法進(jìn)行分組及造模。復(fù)氧結(jié)束后，加20 μL MTT培養(yǎng)4 h，待結(jié)晶物溶解，采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492 nm處檢測(cè)各組的吸光度(A)值作為細(xì)胞增殖能力。

1.6 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡[7]收集活細(xì)胞，按照TUNEL試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，制備好后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，綠色熒光為細(xì)胞凋亡。采用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，對(duì)呈藍(lán)色熒光每張選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，試驗(yàn)組的計(jì)數(shù)為80個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的結(jié)果 具體見(jiàn)表1，由表1可知與對(duì)照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞增殖能力沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的結(jié)果±s，OD值)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 細(xì)胞凋亡的結(jié)果 具體結(jié)果見(jiàn)圖1為A549和SPCA-1的細(xì)胞凋亡圖。由圖1可知與對(duì)照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞凋亡均明顯增加(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)。

2.3 細(xì)胞遷移結(jié)果 A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目見(jiàn)圖2和表2，由圖2和表2可知與對(duì)照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.001)。

分組A549SPCA?1對(duì)照組135．6±20．5253．3±25．6DPP組106．3±22．3?123．7±26．3?(八寶丹+DDP)組20．0±5．9?#45．3±12．1?#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.001；與DDP組比較，#P<0.001。

3 討論

八寶丹的主要成分是牛黃、蛇膽、羚羊角、珍珠、三七、麝香等。藥理學(xué)研究表明三七可增強(qiáng)免疫活性、保肝利膽、抗炎消腫、緩解各種疼痛[8]；牛黃可調(diào)節(jié)腫瘤患者的免疫機(jī)能、誘發(fā)細(xì)胞凋亡[9]；蛇膽、羚羊角、珍珠、麝香可改善血液循環(huán)，具有抗氧化及抗炎作用[10]。有研究[11，12]顯示惡性腫瘤患者在化療的過(guò)程中長(zhǎng)期服用八寶丹可以減少化療藥物的毒副作用，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。但是將其應(yīng)用于人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系對(duì)順鉑化療敏感性的研究并不多見(jiàn)，而且八寶丹是否可以起到降低順鉑化療敏感性的作用，也是本研究需要研究的內(nèi)容。

順鉑是臨床上用于治療惡性腫瘤的一線藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)直接作用于腫瘤細(xì)胞的DNA，破壞腫瘤細(xì)胞的DNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。八寶丹是一種中成藥，可以多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)患者機(jī)體，在一定程度上可以降低鉑類藥物的毒副作用。有研究[13]報(bào)道中藥及其組方制劑可以對(duì)鉑類藥物的毒副作用起到預(yù)防和減輕的作用，而且其中部分中藥可以增強(qiáng)鉑類藥物抗腫瘤的效果。而關(guān)于八寶丹與順鉑的聯(lián)合能否增強(qiáng)順鉑的化療效果，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究認(rèn)為多種中藥可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用，并對(duì)順鉑的耐藥可起到一定的逆轉(zhuǎn)作用[14]，使腫瘤的耐藥細(xì)胞迅速凋亡，提高順鉑的藥效，并減少對(duì)患者的毒副作用。

本研究通過(guò)八寶丹聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞系的處理，分別對(duì)順鉑、八寶丹+順鉑對(duì)人肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞增殖及A549和SPCA-1的細(xì)胞遷移情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示A549的細(xì)胞增殖能力明顯高于SPCA-1細(xì)胞增殖能力，但是八寶丹+順鉑處理后A549和SPCA-1細(xì)胞的增殖能力顯著低于對(duì)照組，但與順鉑處理組的腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯差異；通過(guò)八寶丹+順鉑處理后A549和SPCA-1細(xì)胞的凋亡較順鉑單藥組明顯增加；經(jīng)過(guò)八寶丹+DDP處理的A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目均要比順鉑處理的少。結(jié)果表明經(jīng)八寶丹處理后的腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，凋亡增加，細(xì)胞遷移數(shù)目減少?？梢?jiàn)八寶丹能增強(qiáng)DDP化療敏感性，提高順鉑的化療效果。

綜上所述，八寶丹+DDP可以增加癌細(xì)胞的凋亡，降低A549和SPCA-1細(xì)胞遷移數(shù)目，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的DDP化療敏感性。

[1] McKeage M J．Comparative adverse effect profiles of platinum drugs[J]．Drug Saf，1995，13(4):228-244．

[2] Weiss R B，Christian M C.New cisplatin analogs in development-a review[J]Drugs，1993，46(3):360-377．

[3] 溫海東,呂軍,劉俊,等.八寶丹聯(lián)合α1腎上腺素能受體阻滯劑治療IIIB型慢性前列腺炎的臨床研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,25(9):964-966.

[4] 沈美蓉,裴彬,李仲平.八寶丹膠囊治療黃疽型病毒性肝炎臨床研究[J].河北中醫(yī),2012,34(4):492-494.

[5] 郭雋馥，王艷杰，苗蘭英等.四君子丸含藥血清對(duì)人肺腺癌SPCA1細(xì)胞凋亡及Caspase-3/8/9表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥2015年第26卷第6):1293-1295.

[6] 夏明,童建華,高坦鵬,等.曲馬多聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549侵襲和遷移的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2015,31(4):391-394.

[7] 何進(jìn)喜,宋旭梅,于亮等.在順鉑耐藥的A549 / DDP人肺腺癌細(xì)胞中乙醛脫氫酶表達(dá)增加[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(5):625-629.

[8] 楊振橘.三七藥理作用及真?zhèn)舞b別探討[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育.2016,14(8):64-65.

[9] 張宇靜，夏晶，仇佳思，等.牛黃中膽汁酸的藥理作用及定量分析方法研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志2016,43(2):268-273.

[10]吳皓,李鴻,祁鑫,等.八寶丹對(duì)結(jié)腸癌荷瘤小鼠的血、脾和骨髓中的髓系抑制性細(xì)胞的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)),2014,29(2):568-570.

[11] 耿冬梅,張良明,隋銘華.八寶丹膠囊輔助晚期腫瘤化療的研究[J].山西醫(yī)藥雜志,2010,39(6):562-564.

[12] 朱憲軍，張學(xué)德.八寶丹防治腫瘤化療毒副作用的臨床觀察[J].中國(guó)民間療法.2006，14(5):45-46.

[13] 劉暢,錢彥方,胡京紅,等.益氣養(yǎng)陰除結(jié)方聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,38(12):823-830.

[14] 王理鋒,黃曉慶.黃芪總苷對(duì)肺腺癌SPCA-1細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中國(guó)藥房,26(25):3502-3504.

Effect on sensitivity to cisplatin after Babaodan treatment of human lung adenocarcinoma cells A549 and SPCA-1

CHENG Yu1LI Honglun2

1 Department of Medical Imaging,Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University,Yantai,264000,P.R.China 2 Department of Medical Oncology,Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University

Objective To study the babaodan treatment of human lung adenocarcinoma cell line A549 and line SPCA-1 to cisplatin (DDP) chemotherapy sensitivity.Methods Collected human lung adenocarcinoma A549 and SPCA-1 cell lines for different treatment,were randomly divided to control group (or not),DDP group (4 UM),babaodan DDP group (0.75 mg/kg+4 UM),treatment was 3 weeks,used MTT assay to detect the ability of cell proliferation,used terminal deoxynucleotidyl transfer enzyme mediated D UTP nick end labeling determination (TUNEL) method to detect apoptosis rate, used Transwell assay to detect the ability of cell migration.Results Compared with the control group,the A549 and SPCA-1 cell proliferation of DDP group and babaodan+DDP group decreased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,the A549 and SPCA-1 cell proliferation of babaodan+DDP group had no significant difference (P>0.05).And compared to the control group,the DDP group and babaodan+DDP group of A549 and SPC-A-1 cells apoptosis increased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,babaodan+DDP group on A549 and SPC-A-1 cells apoptosis increased significantly (P<0.05).And compared to the control group,A549 and SPC-A-1 cell migration number of DDP group and babaodan+DDP group decreased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,babaodan+DDP group on A549 and SPC-A-1 cell migration number decreased significantly (P<0.001).Conclusion Babaodan DDP can increase the apoptosis of cancer cells,reduces the proliferation of cancer cells,reduces cells and the number of migrated of the A549 and SPC-A-1, and enhances the chemotheropy sensitivity of DDP.

lung adenocarcinoma;babaodan;cisplatin;chemotheropy sensitivity

煙臺(tái)市發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012092)

李洪倫，Email:liubaodong123@yeah.net

R734.2

A

1001-9510(2016)06-0414-04

2016-06-12)