田玉蘭，蘇凱麒，邱先鑫，方佳如，秦 臻，李 蓉，王 平

（浙江大學(xué)生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生儀學(xué)院，杭州310027）

基于鼠精細(xì)胞的味覺(jué)阻抗傳感器用于苦味物質(zhì)檢測(cè)的研究

田玉蘭，蘇凱麒，邱先鑫，方佳如，秦 臻，李 蓉，王 平*

（浙江大學(xué)生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生儀學(xué)院，杭州310027）

本文設(shè)計(jì)了一種基于雄鼠精細(xì)胞的細(xì)胞阻抗傳感器用于苦味物質(zhì)的特異性檢測(cè)。雄鼠精細(xì)胞內(nèi)含有大量T2Rs受體（G蛋白偶聯(lián)受體）可以對(duì)苦味物質(zhì)產(chǎn)生特異性響應(yīng)，苦味受體被苦味物質(zhì)激活后產(chǎn)生的響應(yīng)會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)骨架的變化，從而可以被細(xì)胞阻抗傳感器檢測(cè)。本文探索了實(shí)驗(yàn)的最佳細(xì)胞密度，檢測(cè)了苯硫脲和奎寧兩種常見(jiàn)的苦味物質(zhì)的響應(yīng)，苯硫脲檢測(cè)范圍為10 μmol/L～200 μmol/L，檢出限為4 μmol/L；奎寧檢測(cè)范圍為62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，檢出限為40 μmol/L。傳感器阻抗值增量與苦味物質(zhì)濃度呈一定的線性相關(guān)性。此外，論文對(duì)該味覺(jué)傳感器的特異性進(jìn)行了測(cè)試分析，表明了基于細(xì)胞傳感器的檢測(cè)方法為代替動(dòng)物和人的苦味測(cè)試提供了一種可能的新的手段。

苦味檢測(cè)；細(xì)胞阻抗傳感器；精細(xì)胞

苦味識(shí)別是生物機(jī)體的一種防御機(jī)制，由于自然界中很多有毒物質(zhì)都是苦的，對(duì)苦味的識(shí)別能有助于動(dòng)物避免攝入有毒和有害物質(zhì)，在動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中具有重要作用。因此苦味識(shí)別技術(shù)在食品安全，環(huán)境檢測(cè)及藥物篩選等方面具有重要價(jià)值。傳統(tǒng)的味覺(jué)傳感器，或稱電子舌［1］，其關(guān)鍵因素在于獲取靈敏度高和特異性好的敏感材料以達(dá)到在復(fù)雜環(huán)境下高效檢測(cè)的結(jié)果。然而傳統(tǒng)的敏感元件通常面臨靈敏度低，檢測(cè)種類(lèi)有限的困難。因此仿生味覺(jué)傳感器中的細(xì)胞傳感器以其高度的生物特異性及靈敏度受到廣泛關(guān)注。但仿生傳感器存在受體細(xì)胞難以獲取和細(xì)胞與器件的耦合問(wèn)題。

苦味受體細(xì)胞是表達(dá)有苦味受體的一類(lèi)特殊的細(xì)胞，主要在口腔味蕾的受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［2-4］。同時(shí)，研究表明，在小鼠睪丸組織中也有大量的苦味受體基因的表達(dá)［5-8］?？辔妒荏w是一類(lèi)7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）中的T2Rs家族（第二類(lèi)味覺(jué)受體家族），對(duì)苦味物質(zhì)具有高度特異性［6，9］。苦味受體被相應(yīng)配體及激動(dòng)劑激活后，通過(guò)特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如細(xì)胞形態(tài)，生理及膜電位變化［3］。細(xì)胞阻抗傳感器是一種可以通過(guò)檢測(cè)電極之間的阻抗變化來(lái)反映生長(zhǎng)在電極之上的細(xì)胞的形態(tài)變化的傳感器，具有長(zhǎng)期無(wú)侵入監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化的特點(diǎn)，研究表明阻抗傳感器可以檢測(cè)GPCR被激活后引起的細(xì)胞形態(tài)變化［10-11］。

基于以上論述，本文提出采用雄鼠精細(xì)胞作為味覺(jué)細(xì)胞傳感器的敏感材料，細(xì)胞阻抗傳感器作為二級(jí)傳感器來(lái)檢測(cè)苦味物質(zhì)的方法，由于睪丸內(nèi)存在大量游離的生殖細(xì)胞，因此作為構(gòu)建細(xì)胞傳感器敏感單元的細(xì)胞源具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且相對(duì)于表達(dá)在異源系統(tǒng)的苦味受體細(xì)胞系，原代生殖細(xì)胞能對(duì)苦味產(chǎn)生更為特異的細(xì)胞響應(yīng)。細(xì)胞阻抗傳感器用于苦味受體被激活后引起的細(xì)胞形態(tài)的變化。因此，利用雄鼠精細(xì)胞對(duì)苦味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，苦味物質(zhì)引起精細(xì)胞的形態(tài)變化將被阻抗傳感器以阻抗的形式表現(xiàn)出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)苦味物質(zhì)的檢測(cè)。該方法靈敏度高，細(xì)胞易獲取且操作簡(jiǎn)單，因此在代替動(dòng)物和人進(jìn)行苦味物質(zhì)的檢測(cè)的方面具有廣泛應(yīng)用的潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：HS培養(yǎng)液：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2， 1 MgCl2，30 HEPES（生物緩沖劑），10 glucose（葡萄糖），10 lactic acid（乳酸）和1 pyruvid acid（丙酮酸），單位 mmol/L，用 NaOH調(diào)節(jié) pH至 7.4；5 mg/mL BSA溶液（稀釋液為HS溶液）；25%烏拉坦；Cell-Tak試劑（細(xì)胞粘合劑）；苯硫脲（PTC），奎寧（Quinine），苯甲地那銨（Dena），檸檬酸（CA），蔗糖（Suc），食鹽（NaCl），谷氨酸鈉（MSG），以上試劑均購(gòu)買(mǎi)自阿拉丁。

儀器：手術(shù)剪，鑷子，均購(gòu)買(mǎi)自上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠；22 μm過(guò)濾器，購(gòu)買(mǎi)自Corning（New York，America）；超純水機(jī)，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)香港力康（Heal Force）生物醫(yī)療科技控股有限公司；電子天平，購(gòu)買(mǎi)自METTLER-TOLEDO（Zurich，Switzerland）。

1.2 系統(tǒng)檢測(cè)原理

細(xì)胞電極阻抗傳感，由 Giaever和 Keese在1984年首次提出，是一種可用于監(jiān)測(cè)離體培養(yǎng)細(xì)胞行為的傳感器［12-13］。細(xì)胞在ECIS傳感器電極上的貼附、生長(zhǎng)和死亡等可以改變電極的電場(chǎng)分布從而引起電阻抗的變化。傳感器通過(guò)檢測(cè)電極間的阻抗變化可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞貼附及細(xì)胞形態(tài)變化［14］。由于細(xì)胞阻抗傳感器具有無(wú)標(biāo)記，非侵入，可定量，實(shí)時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，常用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞貼附及形態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，貼附及凋亡，在藥物篩選，細(xì)胞毒性觀測(cè)上有廣泛應(yīng)用［15］。圖1為傳感器的檢測(cè)原理圖和檢測(cè)系統(tǒng)。

圖1 基于雄鼠精細(xì)胞的阻抗傳感器的檢測(cè)系統(tǒng)介紹

圖1A為8周左右的雄鼠經(jīng)過(guò)麻醉后取雄鼠精細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖1B為傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)濃度的檢測(cè)原理，精細(xì)胞貼附于叉指電極表面，當(dāng)加入苦味物質(zhì)時(shí)，由于苦味物質(zhì)與苦味受體結(jié)合激活GPCR蛋白導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的變化，該變化會(huì)反映到細(xì)胞-電極之間的電阻變化，通過(guò)阻抗即可表現(xiàn)出加入苦味物質(zhì)濃度的變化。圖1C傳感器電路檢測(cè)系統(tǒng)原理示意圖：主要包括信號(hào)發(fā)生模塊、前置放大濾波模塊、模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊和中央處理器模塊［16-17］。檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)信號(hào)發(fā)生模塊產(chǎn)生微小的正弦電壓信號(hào)，并將這個(gè)微小的電壓信號(hào)加載在多通道傳感器上，會(huì)在傳感器叉指電極上形成離子電流，傳感器輸出電流經(jīng)過(guò)放大和濾波模塊，被數(shù)模轉(zhuǎn)換模塊采集，最后通過(guò)激勵(lì)信號(hào)的幅值和輸出電流的幅值，即可計(jì)算出每個(gè)通道的阻抗大小。圖1D為本實(shí)驗(yàn)室的16通道檢測(cè)儀器及阻抗板的實(shí)物。圖1E為上位機(jī)測(cè)量系統(tǒng)，用于實(shí)時(shí)顯示阻抗的變化。

在利用阻抗對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，常使用細(xì)胞指數(shù)來(lái)表征細(xì)胞的狀態(tài)［18-19］，其中細(xì)胞指數(shù)與阻抗之間的關(guān)系如下：

式中，CIk(t)表示k通道的細(xì)胞在t時(shí)刻的細(xì)胞指數(shù)，Zk(t)表示k通道在t時(shí)刻的阻抗值，Zk(0)為k通道檢測(cè)的初始點(diǎn)的阻抗值，Zk為k通道的腔內(nèi)阻抗值，為了進(jìn)一步檢測(cè)苦味物質(zhì)的濃度變化對(duì)細(xì)胞的影響，我們引入歸一化細(xì)胞指數(shù)的概念，歸一化細(xì)胞指數(shù)與細(xì)胞指數(shù)的關(guān)系如下：

式中，NCIk(t)表示k通道的歸一化細(xì)胞指數(shù)，CIk(t)表示k通道的t時(shí)刻的細(xì)胞指數(shù)，CIk(tn)表示k通道歸一化點(diǎn)tn的細(xì)胞指數(shù)值。

利用NCIk(t)的值隨不同溶液濃度的變化而變化即可以檢測(cè)所加溶液的濃度。

1.3 方法

1.3.1 阻抗板的包被

阻抗板用Cell-Tak溶液包被，放置于4℃環(huán)境下過(guò)夜或者37℃環(huán)境下放置1 h，實(shí)驗(yàn)前吸干殘余液，晾干阻抗板，備用。

1.3.2 雄鼠精細(xì)胞提取

手術(shù)剪消毒；選用一只8周左右的野生型的雄鼠，用25%烏拉坦腹腔注射麻醉；用鑷子及手術(shù)剪取出兩側(cè)睪丸，去除脂肪墊、白膜及血管，將曲細(xì)精管置于HS溶液中；用HS溶液將曲細(xì)精管吹打洗滌3次使其分散以及除去血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞；用鑷子將曲細(xì)精管剪碎呈半液體狀態(tài)，置于含有5 mg/mL BSA（bovine serum albumin）的HS培養(yǎng)液中；用吸管反復(fù)吹打組織碎片，用過(guò)濾網(wǎng)除去組織碎片，分離精細(xì)胞；700 r/min離心1 min，將包含大量精細(xì)胞的上清液分離出來(lái)；稀釋20倍后計(jì)數(shù)，細(xì)胞溶液用培養(yǎng)基稀釋至400萬(wàn)個(gè)/mL；將所得精細(xì)胞溶液接種在2個(gè)8孔阻抗板中，每孔180 μL；將接種后的兩板細(xì)胞載入EICS-16系統(tǒng)中，放置于37℃的培養(yǎng)箱中開(kāi)始檢測(cè)；120 min（阻抗信號(hào)平穩(wěn)）后加藥進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞密度探索

我們對(duì)不同細(xì)胞密度下精細(xì)胞阻抗傳感器的靈敏度進(jìn)行了探索，分別測(cè)試了在10萬(wàn)個(gè)/mL、50萬(wàn)個(gè)/mL、100萬(wàn)個(gè)/mL、200萬(wàn)個(gè)/mL、400萬(wàn)個(gè)/mL、600萬(wàn)個(gè)/mL的細(xì)胞密度下傳感器對(duì)200 μmol/L的苯硫脲（PTC）的響應(yīng)。

1.3.4 苦味物質(zhì)濃度的測(cè)試

奎寧：使用HS緩沖液配制濃度為5 μmol/L，20 μmol/L，62.5 μmol/L，125 μmol/L，250 μmol/L，500 μmol/L，1 000 μmol/L，2 000 μmol/L的奎寧溶液，待傳感器細(xì)胞阻抗平穩(wěn)后加入不同濃度溶液，每個(gè)濃度做四組實(shí)驗(yàn)。

PTC：使用HS緩沖液配制濃度為0.4 μmol/L，2 μmol/L，10 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L，1 000 μmol/L，2 000 μmol/L的PTC溶液，待傳感器細(xì)胞阻抗平穩(wěn)后加入不同濃度溶液，每個(gè)濃度做四組實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 特異性測(cè)試

為了考察傳感器對(duì)于苦味物質(zhì)的特異性，我們分別檢測(cè)了雄鼠精細(xì)胞阻抗傳感器對(duì)1 000 μmol/L的苯甲地那銨（Dena），檸檬酸（CA），蔗糖（Suc），食鹽（NaCl），谷氨酸鈉（MSG）以及HS溶液的響應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 密度探索結(jié)果分析

圖2（a）為不同細(xì)胞密度下雄鼠精細(xì)胞在阻抗板上面的貼附情況圖，圖2（b）為不同細(xì)胞密度下傳感器對(duì) 200 μmol/L的 PTC溶液的阻抗響應(yīng)曲線。

由圖2（a）可看出細(xì)胞貼附數(shù)量隨著加入溶液的細(xì)胞密度的增加而增加，當(dāng)細(xì)胞濃度在10萬(wàn)個(gè)/mL到400萬(wàn)個(gè)/mL之間時(shí)，其貼附數(shù)量逐漸增加，到400萬(wàn)個(gè)/mL時(shí)基本上整個(gè)金電極表面幾乎都有細(xì)胞貼附，600萬(wàn)個(gè)/mL與400萬(wàn)個(gè)/mL濃度下細(xì)胞的貼附數(shù)量無(wú)太大變化，其細(xì)胞貼附面積與每孔電極面積的比值分別為1%、10%、40%、75%、95%和96%。圖2（b）表明對(duì)于濃度為200 μmol/L的PTC溶液，不同細(xì)胞濃度下傳感器的響應(yīng)幅度存在差異，當(dāng)細(xì)胞種植密度在400萬(wàn)個(gè)/mL以下時(shí)，其響應(yīng)幅度隨著細(xì)胞密度的增加而增加，當(dāng)細(xì)胞種植密度大于400萬(wàn)個(gè)/mL時(shí)，其響應(yīng)與400萬(wàn)個(gè)/mL相比無(wú)明顯增加，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞種植密度在400萬(wàn)個(gè)/mL左右時(shí)，精細(xì)胞幾乎在整個(gè)金電極表面均有貼附，再增加種植密度，貼附細(xì)胞數(shù)量并不會(huì)顯著增加?？梢虼宋覀冞x擇400萬(wàn)個(gè)/mL作為實(shí)驗(yàn)時(shí)的細(xì)胞溶度。

圖2 貼附情況和阻抗響應(yīng)曲線

2.2 苦味物質(zhì)測(cè)試結(jié)果分析

圖3（a）為精細(xì)胞阻抗傳感器對(duì)不同濃度PTC溶液的實(shí)時(shí)響應(yīng)曲線，右圖為細(xì)胞-電極阻抗變化值與奎寧濃度之間的擬合關(guān)系（mean±SD，n=4）其中mean為平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差，n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)，右圖表明PTC的濃度響應(yīng)在10 μmol/L～200 μmol/L內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程為y=0.11x-0.07，線性相關(guān)系數(shù)為0.95。檢測(cè)限通過(guò)計(jì)算空白響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差的3倍計(jì)算得出，大小為4 μmol/L。

圖4（a）為精細(xì)胞阻抗傳感器對(duì)不同濃度奎寧溶液的實(shí)時(shí)響應(yīng)曲線，右圖為細(xì)胞-電極阻抗變化值與奎寧濃度之間的擬合關(guān)系（mean±SD，n=4），圖4（b）表明奎寧的濃度響應(yīng)在67.5 μmol/L～1 000 μmol/L內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程為y=0.05x-0.09，線性相關(guān)系數(shù)為0.96。檢測(cè)限通過(guò)計(jì)算空白響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差的3倍計(jì)算得出，大小為40 μmol/L。

圖3 苦味PTC阻抗響應(yīng)曲線及其標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 苦味奎寧阻抗響應(yīng)曲線及其標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 系統(tǒng)特異性分析

為了考察傳感器對(duì)于苦味物質(zhì)的特異性，我們分別檢測(cè)了該傳感器對(duì)1 000 μmol/L的Dena，CA，Suc，NaCl，MSG以及Buffer溶液的響應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。圖5為數(shù)據(jù)進(jìn)行Student’st檢驗(yàn)，可以得出傳感器對(duì)Quin的響應(yīng)顯著高于其他幾種味覺(jué)化合物（P＜0.05）。這是因?yàn)榫?xì)胞中有大量的苦味受體蛋白的表達(dá)，因此精細(xì)胞對(duì)苦味物質(zhì)的響應(yīng)具有特異性，而精細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有其他幾種味道的受體，因此對(duì)其他物質(zhì)的響應(yīng)很小。

圖5 阻抗響應(yīng)曲線和特異性檢測(cè)分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種基于鼠精細(xì)胞的阻抗傳感器用于苦味物質(zhì)的特異性檢測(cè)。該方法結(jié)合了雄鼠精細(xì)胞對(duì)苦味物質(zhì)具有特異性響應(yīng)和細(xì)胞阻抗傳感器實(shí)時(shí)無(wú)侵入測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附、形態(tài)變化的特點(diǎn)，提出了一種檢測(cè)苦味物質(zhì)的新方法。我們探索了使細(xì)胞貼附在電極上的方法，實(shí)驗(yàn)最佳細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)PTC線性檢測(cè)濃度范圍為10 μmol/L～200 μmol/L，檢測(cè)限為4 μmol/L；奎寧檢測(cè)范圍為線性62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，檢測(cè)限為40 μmol/L。此外，通過(guò)檢測(cè)傳感器對(duì)其他不同味覺(jué)物質(zhì)的響應(yīng)，表明這種方法對(duì)苦味物質(zhì)具有特異性的響應(yīng)。與傳統(tǒng)的味覺(jué)傳感器比較，該方法具有靈敏度高、特異性好、并且細(xì)胞易獲取的優(yōu)點(diǎn)，此外，采用的仿生細(xì)胞傳感器的檢測(cè)方法在代替動(dòng)物和人實(shí)現(xiàn)苦味物質(zhì)的檢測(cè)方面具有廣泛應(yīng)用的前景。

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田玉蘭（1990.04），女，浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程2014級(jí)碩士研究生，從事生物醫(yī)學(xué)工程與生物醫(yī)學(xué)傳感器研究，cnyltian@ zju.edu.cn；

王 平（1962-），男，浙江大學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)閭鞲衅髋c檢測(cè)技術(shù)、生物芯片與生物電子學(xué)、人工嗅覺(jué)與人工味覺(jué)等，cnpwang@zju.edu.cn。

A Study on Mouse Germ Cell-Based Sensor for the Detection of Bitterness

TIAN Yulan，SU Kaiqi，QIU Xianxin，F(xiàn)ANG Jiaru，QIN Zheng，LI Rong，WANG Ping*
（Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory for Biomedical Engineering，Ministry of Education，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou310027，China）

In this study，the feasibility of utilizing male mouse germ cells in testis and electrical cell-substrate impedance sensor（ECIS）was explored to build a cell-based bitter biosensor，which can sensitively and specifically respond to bitter compounds.Male mouse germ cells express lots of bitter receptor T2Rs（G protein coupled receptors）which can sensitively and specifically respond to bitter compounds，when active by ligands will affect cell morphology in a specific manner.The best cell density was explored；cell-impedance response profiles of germ cells to two bitter compounds were investigated by analyzing the response intensity under various concentrations，The linear detection range of PTC is 10 μmol/L～200 μmol/L，the detection limit is 4 μmol/L；the linear detection range of quinine is 62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，the detection limit is 4 μmol/L； Furthermore，impedance responses to five basic tastes were examined to evaluate the specificity of cell-based bitter biosensor in bitter detection.The results revealed that this hybrid bitter biosensor could respond to those bitter compounds in a dose-dependent manner.And it could respond to bitter compounds specifically.This biosensor may provide a promising approach for detecting various bitter compounds.

biosensor；bitter taste receptor；electrical cell-substrate impedance sensor；male mouse germ cells

R318

A

1004-1699（2016）12-1785-06

??7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2016.12.001

2016-04-25修改日期：2016-07-18