李艷敏，李翠翠，鄭 航，田方圓，王臺(tái)安，田亞東，李轉(zhuǎn)見，康相濤，劉小軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，河南省家禽育種國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

雌激素通過ER-α調(diào)控CYP2C8在雞肝中的表達(dá)

李艷敏，李翠翠，鄭 航，田方圓，王臺(tái)安，田亞東，李轉(zhuǎn)見，康相濤，劉小軍*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，河南省家禽育種國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

本研究旨在探討雞CYP2C8基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。采集30周齡盧氏綠殼蛋雞心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指腸、空腸、回腸14種組織以及從1日齡～30周齡不同發(fā)育時(shí)期的肝組織，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析CYP2C8基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律；用雌激素及其受體拮抗劑對(duì)活體和體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細(xì)胞進(jìn)行處理，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析CYP2C8基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明，雞CYP2C8基因在各組織中表現(xiàn)出廣泛表達(dá)的特性，但在脂類代謝旺盛的器官如肝、腎、小腸(十二指腸、空腸、回腸)等器官中表達(dá)較高，且在肝中的表達(dá)水平隨著性成熟而顯著升高(P<0.01)；雌激素處理可顯著提高雞肝組織和體外培養(yǎng)的雞胚胎肝原代細(xì)胞中CYP2C8的表達(dá)水平(P<0.05)，但雌激素受體ER-α拮抗劑MPP可完全抑制雌激素的作用(P<0.05)。綜上表明，雞CYP2C8基因在不同組織中廣泛表達(dá)，而以肝中的表達(dá)水平最高，且肝中CYP2C8基因的表達(dá)是受雌激素并通過ER-α調(diào)控。

肝；CYP2C8基因；表達(dá)調(diào)控；雌激素

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450或P450)是一組含血紅素的蛋白質(zhì)，由結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因超家族編碼形成的超家族酶系[1]，因還原型CYP450蛋白與一氧化碳復(fù)合物在450 nm處有特異性吸收峰而得名[2]。CYP2C8基因是P450家族的重要成員[3]，哺乳動(dòng)物的研究表明，CYP2C8基因在腎、肺、鼻黏膜、內(nèi)皮黏膜、心都有表達(dá)，但肝組織表達(dá)最高[4-7]，主要參與體內(nèi)藥物代謝[8-11]，如人CYP2C8基因主要參與體內(nèi)抗糖尿病藥物羅格列酮和曲格列酮、抗癌藥物紫杉醇、降膽固醇藥物西立伐他汀等的代謝[11]和內(nèi)源性分子花生四烯酸到環(huán)氧化二十碳三稀酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs) 等的代謝[12]。

PPARα是PPAR轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞型，是一種營養(yǎng)傳感器，能調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝，影響脂肪生成和酮體合成[13]。雞PPARα基因在肝、心、腎和尾脂腺組織中表達(dá)量較高[14]，而熊敏等[15]在初生肉雞中研究表明PPARα只在肝中表達(dá)，推測其在初生肉雞肝脂肪代謝中起重要的作用，然而CYP2C8基因作為PPARα新靶基因[16]，筆者推測其可能參與家禽調(diào)控脂質(zhì)代謝。

通過對(duì)產(chǎn)蛋前期母雞(20周齡)和產(chǎn)蛋高峰期母雞(30周齡)肝組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C8基因的表達(dá)水平在產(chǎn)蛋高峰期雞肝組織顯著升高[17]，表明CYP2C8基因在產(chǎn)蛋期母雞肝代謝中可能發(fā)揮重要的生理功能。由于產(chǎn)蛋期母雞肝需要合成大量的低密度脂蛋白(VLDL)及卵黃前期物(VTG)等脂類物質(zhì)[18]，產(chǎn)蛋雞肝的代謝活動(dòng)多與脂質(zhì)代謝有關(guān)，而且這一過程一般認(rèn)為受雌激素調(diào)控[19]。而有關(guān)CYP2C8基因在雞的時(shí)空表達(dá)規(guī)律及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制迄今未見報(bào)道。本研究將分析CYP2C8基因在不同組織和不同生長階段的表達(dá)模式，同時(shí)探討其在雌激素誘導(dǎo)下的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，為進(jìn)一步闡明CYP2C8基因在產(chǎn)蛋期母雞肝脂質(zhì)代謝中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

選取不同發(fā)育時(shí)期(1日齡、1周齡、10周齡、15周齡、20周齡和30周齡)體重相近的健康河南省優(yōu)良地方雞品種盧氏綠殼蛋雞各6只，頸部放血處死后，采集心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指腸、空腸、回腸14種組織，于液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。選取體重相近的健康10周齡的海蘭褐蛋雞70只，隨機(jī)分為4組，前3組中每組20只，各組分別按0.5、1.0和2.0 mg·kg-1體重肌肉注射溶于無水乙醇的3種不同濃度的17β-雌二醇(Sigma，美國)，第4組10只雞為對(duì)照組，注射等量的溶劑。各試驗(yàn)組在17β-雌二醇注射12 h后隨機(jī)挑選10只雞，頸部放血處死，采集肝組織，于液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。各試?yàn)組剩余個(gè)體在17β-雌二醇注射24 h后與對(duì)照組一起，采用與上述同樣的方法處死，采集并保存樣品。

1.2 雞胚肝原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

購自于北京梅里亞維通試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司SPF種蛋消毒后，置于溫度38 ℃，濕度97%條件下孵化，孵化過程中自動(dòng)翻蛋。孵化至17胚齡時(shí)取出，用酒精消毒后，打開蛋殼鈍端并揭開氣室膜，于超凈臺(tái)中取出雞胚，打開雞胚腹腔，取出肝，用D-Hank’s溶液進(jìn)行清洗，并剔除非肝組織部分，然后移入加有D-Hank’s的燒杯中，用手術(shù)剪將肝組織剪成1 mm3的小塊，隨后加入0.1%的膠原酶IV進(jìn)行消化，待消化完成后，用100目、500目細(xì)胞篩過濾，取過濾后的細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1，5 min離心3次細(xì)胞懸液，吸取上清液，加入Williams’E培養(yǎng)液重懸，采用Percoll梯度離心法純化肝細(xì)胞，將純化后的肝原代細(xì)胞用含胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)液重懸，采用臺(tái)盼蘭染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×105個(gè)·mL-1種植于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的雜細(xì)胞和細(xì)胞碎片，待細(xì)胞生長到80%融合時(shí)，更換為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理6 h，然后用不同濃度的17β-雌二醇(1、50、100 mg·L-1)、MPP(100 mg·L-1)、 ICI 182,780、Tamoxifen(100 mg·L-1)(均購自Sigma，美國)單獨(dú)或混合處理細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，-80 ℃保存。

1.3 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

參照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取組織和細(xì)胞RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照Ensemble中雞CYP2C8(ENSGALG-000000 26793)和NCBI中β-actin(MGL-1_205518.1)、ApoVLDLII(MGL-1_205483.2)基因mRNA序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，退火溫度為60 ℃，由上海生工生物有限公司合成。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增片段的大小

Table 1 The Primer sequences and Product size for PCR

基因Gene引物序列(5′→3′)Primersequence產(chǎn)物長度/bpLengthCYP2C8F：GTTTGCAGGTCCCAGTTCAG，R：TCCTTCCCTCTTTGCGATGT152β?actinF：CAGCCAGCCATGGATGATGA，R：ACCAACCATCACACCCTGAT118ApoVLDLIIF：CAATGAAACGGCTAGACTCA，R：AACACCGACTTTTCTTCCAA108

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)QuantiFastSYBR GreenPCR的試劑盒的操作說明，以β-actin為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CYP2C8基因的表達(dá)量，同一反應(yīng)重復(fù)3次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為2×QuantiFastSYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL,用RNase-Free水補(bǔ)足到20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較不同組織、不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)水平，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。圖中數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(圖1除外)。

2 結(jié) 果

2.1 雞CYP2C8基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律

將各組織6個(gè)個(gè)體的cDNA樣品等量混合，以β-actin為內(nèi)參，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，雞CYP2C8基因在心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰臟、十二指腸、空腸、回腸等組織中均有不同程度的表達(dá)，尤其在脂類代謝旺盛的器官如肝、腎、小腸(十二指腸、空腸、回腸)等器官中表達(dá)水平較高，且以肝的表達(dá)水平最高(圖1)。

圖1 雞CYP2C8基因在30周齡個(gè)體不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression level of CYP2C8 gene in different tissues of chicken at 30 weeks old

2.2 雞CYP2C8基因在肝組織中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律

對(duì)1日齡、1周齡、10周齡、15周齡、20周齡、30周齡6個(gè)發(fā)育階段肝組織(n=6)中CYP2C8基因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)母雞肝中CYP2C8基因的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋前期(20周齡以前)母雞(P<0.01)肝中CYP2C8基因的表達(dá)量(圖2)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different uppercase letters means very significant difference between groups (P<0.01),the same letter mean no significant difference between groups(P>0.05). The same as below圖2 不同發(fā)育時(shí)期雞肝組織中CYP2C8基因的表達(dá)規(guī)律Fig.2 The relative expression level of CYP2C8 gene in liver of chicken in different development stages

2.3 雌激素處理對(duì)血液指標(biāo)和雞肝內(nèi)CYP2C8基因表達(dá)的影響

2.3.1 雌激素處理對(duì)血液指標(biāo)的影響 雌激素是產(chǎn)蛋期母雞肝脂質(zhì)代謝的主要誘導(dǎo)因子[19-20]，不同濃度的17β-雌二醇(0.5、1.0和2.0 mg·kg-1)處理10周齡青年母雞12 h后，與對(duì)照組相比，血清中的TG含量顯著升高(P<0.05)，TC的含量只在1.0 mg·kg-1組顯著升高(P<0.05)，VLDL-c無顯著變化(P>0.05)；雌激素處理24 h，血清中的TG、 TC和VLDL-c的含量在1.0和2.0 mg·kg-1組顯著升高(P<0.05)(圖3)。

2.3.2 雌激素處理對(duì)雞肝CYP2C8基因表達(dá)的影響ApoVLDLII基因啟動(dòng)子區(qū)含有典型的雌激素受體結(jié)合位點(diǎn)(ERE)[26-27]，可作為生物體對(duì)雌激素反應(yīng)的標(biāo)記基因。不同濃度的17β-雌二醇(0.5、1.0和2.0 mg·kg-1)處理10周齡青年母雞12和24 h后，與對(duì)照組相比，雌激素反應(yīng)的標(biāo)記基因ApoVLDLII的表達(dá)水平都成劑量依賴性顯著升高(P<0.05)(圖4A, B)，表明17β-雌二醇發(fā)揮其正常生理功能。同時(shí)，17β-雌二醇處理12 h后，各試驗(yàn)組中CYP2C8基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比也顯著升高(P<0.05)(圖4C)；17β-雌二醇處理24 h后，1.0和2.0 mg·kg-1組CYP2C8基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但0.5 mg·kg-1組CYP2C8基因的表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)(圖4D)。

A.12 h；B.24 h。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同A.12 h; B.24 h. Different small letters list means significant difference (P<0.05), the same letter show no significant difference between treatments(P>0.05). The same as below圖3 雌激素處理的雞血清中TG、TC和VLDL-c的濃度Fig.3 The concentrations of TG,TC and VLDL-c in different estrogen treatment in chicken serum

2.4 雌激素處理對(duì)雞胚肝原代細(xì)胞中CYP2C8基因表達(dá)的影響

2.4.1 雞胚肝原代細(xì)胞形態(tài)觀察 剛分離(0 h)的雞胚肝原代細(xì)胞成圓形，細(xì)胞單個(gè)或數(shù)個(gè)聚集分布在培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h后雞胚肝原代細(xì)胞開始貼壁。培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞聚集成島嶼狀生長，排列整齊、形似梅花(圖5)。

A，C.12 h;B,D.24 h圖4 不同濃度雌激素處理10周齡母雞對(duì)肝組織中ApoVLDL II(A、B)和CYP2C8(C、D)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different doses of 17β-estradiol on the expression of ApoVLDL II (A,B) and CYP2C8 (C,D) genes in the liver of 10 weeks old pullets after they were treated

A.0 h；B.24 h圖5 雞胚肝原代細(xì)胞生長狀態(tài)Fig.5 The growth state of primary chicken hepatocytes

2.4.2 雌激素處理對(duì)雞胚肝原代細(xì)胞中CYP2C8基因表達(dá)的影響 不同濃度雌激素處理體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，雌激素反應(yīng)的標(biāo)記基因ApoVLDLII的表達(dá)水平都成劑量依賴性顯著升高(P<0.05)(圖6A)，表明17β-雌二醇發(fā)揮其正常生理功能。CYP2C8基因的表達(dá)水平在50和100 mg·L-1濃度處理組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖6B)。

2.5 雌激素受體拮抗劑處理對(duì)雞CYP2C8基因表達(dá)的影響

不同類型的雌激素受體拮抗劑與雌激素共同處理體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細(xì)胞24 h后CYP2C8基因的表達(dá)水平變化見圖7。CYP2C8基因的表達(dá)水平在雌激素單獨(dú)處理組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。雌激素分別與MPP、ICI 182,780和Tamoxifen共處理體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細(xì)胞時(shí)，各組間CYP2C8基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比無顯著變化，但與雌激素單獨(dú)處理組相比則顯著下調(diào)(P<0.05)。因?yàn)镸PP是ER-α的高度選擇性拮抗劑[32]，ICI 182,780和Tamoxifen主要是ER-α和ER-β受體的拮抗劑，且Tamoxifen對(duì)GPR30還表現(xiàn)出高親和力[33]，僅添加MPP時(shí)，雌激素處理組中CYP2C8基因的相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)到對(duì)照組(正常細(xì)胞，無雌激素處理)相同的水平，說明ER-α拮抗劑可使雌激素完全不能發(fā)揮作用，當(dāng)添加ICI 182,780時(shí)，雌激素處理組中CYP2C8基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組和ER-α特異性拮抗劑處理組沒有差異，表明同時(shí)阻斷ER-α，ER-β受體的作用并不能使CYP2C8基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步下降，說明雌激素對(duì)CYP2C8基因表達(dá)的調(diào)控主要通過ER-α介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)。綜上表明，雌激素對(duì)CYP2C8表達(dá)的調(diào)控主要是通過ER-α介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。

圖6 ApoVLDLII(A)、CYP2C8(B)在不同雌激素處理的肝原代細(xì)胞中的表達(dá)量Fig.6 The expression difference of ApoVLDL II(A),CYP2C8(B) in different estrogen treatment in hepatocytes

圖7 雌激素受體拮抗劑MPP、ICI 182, 780(ICI)和Tamoxifen(Tam)與雌激素共處理肝細(xì)胞對(duì)CYP2C8基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of co-treatment of E2 and the ER antagonists ICI 182, 780(ICI), tamoxifen (Tam), and MPP on the expression of CYP2C8 mRNA in hepatocytes

3 討 論

基因的表達(dá)特性與它們?cè)谏矬w生長發(fā)育過程中的功能緊密相關(guān)，因此研究基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律是研究其功能的基礎(chǔ)。本研究對(duì)CYP2C8基因在30周齡盧氏綠殼蛋雞14種組織的表達(dá)分析表明，CYP2C8基因在家禽脂類代謝旺盛的組織器官如肝、腎、小腸(十二指腸、空腸、回腸)[21]等的表達(dá)水平較高，且肝的表達(dá)水平最高，從而推斷CYP2C8基因可能參與產(chǎn)蛋期雞脂類代謝過程。這與有關(guān)CYP2C8基因在人的肝組織較高表達(dá)的研究[4-7]結(jié)果一致。

進(jìn)一步對(duì)CYP2C8基因在不同生理期的盧氏綠殼蛋雞肝組織的時(shí)序表達(dá)分析表明，CYP2C8基因在產(chǎn)蛋前雞(1日齡～20周齡)肝組織表達(dá)水平較低,而在產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)顯著升高達(dá)10倍左右。與產(chǎn)蛋前期母雞相比，產(chǎn)蛋期母雞最明顯的生理變化是肝脂肪和蛋白代謝顯著加強(qiáng)，合成胚胎發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，轉(zhuǎn)運(yùn)到生長的卵母細(xì)胞形成蛋黃。CYP2C8基因在產(chǎn)蛋期母雞肝組織表達(dá)的顯著升高，進(jìn)一步表明CYP2C8基因可能參與產(chǎn)蛋期雞脂類代謝過程。

產(chǎn)蛋期母雞體內(nèi)脂類代謝是受激素調(diào)控的[22-24]。已有的研究表明，血清中雌激素水平隨著性成熟逐步升高，21周齡產(chǎn)蛋母雞血清中雌激素水平比6周齡青年母雞血清中雌激素水平升高450%[25]。為了進(jìn)一步研究雌激素對(duì)CYP2C8基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，構(gòu)建了雌激素誘導(dǎo)的個(gè)體和雞胚肝原代細(xì)胞模型。由于ApoVLDLII基因啟動(dòng)子區(qū)具有典型的雌激素反應(yīng)元件(Estrogen response element ，ERE)[26-27]結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)直接受雌激素的調(diào)控，因此被作為雌激素作用效應(yīng)的標(biāo)記基因。本研究中，10周齡青年母雞經(jīng)不同濃度雌激素處理12 h后，ApoVLDLII基因和CYP2C8基因的表達(dá)水平均顯著升高，血清中的TG和TC含量也顯著升高，但VLDL-c無顯著變化；處理24 h后，與對(duì)照組相比，ApoVLDLII基因的表達(dá)水平仍保持顯著高的水平，CYP2C8基因的表達(dá)水平以及血清中的TG、TC和VLDL-c含量卻只在1.0和2.0 mg·kg-1濃度處理組顯著高于對(duì)照組。1.0 mg·kg-1處理24 h是研究雌激素誘導(dǎo)的肝脂肪代謝較為適合的濃度和時(shí)間點(diǎn)。同樣，不同濃度的雌激素處理肝原代細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，ApoVLDLII基因的表達(dá)水平均顯著升高，但CYP2C8基因的表達(dá)水平只有在濃度為50 和100 mg·L-1處理組顯著高于對(duì)照組，因此，50 mg·L-1是雌激素處理細(xì)胞24 h的合適濃度。

選擇性雌激素受體激動(dòng)劑和拮抗劑是除基因敲除外另一個(gè)研究受體功能的常用方法[28-29]，其中特異性拮抗劑能夠阻斷雌激素受體的作用，從而抑制雌激素對(duì)靶基因的作用。雌激素受體屬于核受體超家族中的成員，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子[30]，主要包括核受體ER-α和ER-β，以及G蛋白耦聯(lián)受體30(GPR30)。雌激素的生物學(xué)功能主要通過ER-α、ER-β和GPR30介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，如李軍等研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠通過核受體ER-α誘導(dǎo)雞肝生成ApoVLDLII和VTG2[31]。研究表明，MPP是ER-α的高度選擇性拮抗劑[32]，ICI 182,780和Tamoxifen主要是ER-α和ER-β受體的拮抗劑，且Tamoxifen對(duì)GPR30表現(xiàn)出高的親和力[33]，在人和石首魚的研究中表現(xiàn)出相當(dāng)于雌二醇的活性。為了進(jìn)一步研究雌激素對(duì)CYP2C8基因的調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)以3種雌激素拮抗劑MPP、ICI 182,780 和Tamoxifen分別與雌激素共同處理雞胚胎肝原代細(xì)胞，分析不同類型拮抗劑對(duì)CYP2C8基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，雌激素調(diào)控雞CY2CC8基因的表達(dá)是通過ER-α介導(dǎo)的。

雌激素通過雌激素受體發(fā)揮生理作用的方式主要有3種：一是通過激活雌激素受體后，直接與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的雌激素受體反應(yīng)元件(ERE)結(jié)合，并募集輔調(diào)控因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而順式激活靶基因調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。二是通過結(jié)合或激活其他可直接結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子來間接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，如激活蛋白AP-1、特異蛋白SP-1、P53等[34]。三是雌激素可通過膜受體介導(dǎo)快速的非基因型效應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)的第二信使，間接調(diào)控一系列基因轉(zhuǎn)錄[35]。關(guān)于雌激素激活ER-α后具體是通過哪種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控雞CYP2C8基因表達(dá)的，還有待進(jìn)一步研究。

[1] 楊海峰. 雞肝微粒體細(xì)胞色素P450的初步研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

YANG H F. Preliminary study on microsomal cytochrome P450 enzymes in chicken[D]. Nanjing： Nanjing agricultural university,2006.

[2] BRINK H M, GORCOM R F, PUNT P J, et al. Cytochrome P450 enzyme systems in fungi[J].FungalGenetBiol, 1998, 23(1):1-17.

[3] MAKIA N L, GOLDSTEIN J A. CYP2C8 is a novel target of peroxisome proliferator-activated receptor α in human liver[J].MolPharmacol, 2016, 89(1): 154-164.

[4] FLEMING I. Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries[J].TrendsCardiovascMed, 2000, 10(4):166-170.

[5] KLOSE T S, BLAISDELL J A, GOLDSTEIN J A. Gene structure of CYP2C8, and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs[J].JBiochemMolToxicol, 1999, 13(6):289-295.

[6] DING X, KAMINSKY L S. Human extrahepatic ctyochrome P450: function in xenobiotic metabolism and tissue-selective chemical toxicity in the respiratory and gastrointestinal tracts[J].AnnuRevPharmacolToxicol, 2003, 43(1):149-173.

[7] DELOZIER T C, KISSLING G E, COULTER S J, et al. Detection of human CYP2C8, CYP2C9 and CYP2J2 in cardiovascular tissues[J].DrugMetabDispos, 2007, 35(4):682-688.

[8] NIEMI M, NEUVONEN M, DALY A K, et al. Polymorphism in CYP2C8, is associated with reduced plasma concentrations of repaglinide[J].ClinPharmacolTher, 2003, 74(4):380-387.

[9] TORNIO A, NIEMI M, NEUVONEN P J, et al. Trimethoprim and the CYP2C8*3 allele have opposite effects on the pharmacokinetics of pioglitazone[J].DrugMetabDispos, 2008, 36(1):73-80.

[10] KIRCHHEINER J, THOMAS S, BAUER S, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of rosiglitazone in relation to CYP2C8 genotype[J].ClinPharmacolTher, 2006, 80(6):657-667.

[11] TOTAH R A, RETTIE A E. Cytochrome P450 2C8: substrates, inhibitors, pharmacogenetics, and clinical relevance[J].ClinPharmacolTher, 2005, 77(5):341-352.

[12] FLEMING I. Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries[J].TrendsCardiovascMed, 2000, 10(4):166-170.

[13] 張 震, 富文俊, 邢宇鋒，等. L-FABP/PPARα信號(hào)通路與非酒精性脂肪性肝炎關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥, 2016, 56(8):98-100.

ZHANG Z, FU W J, XING Y F, et al. Research progress on L-FABP/PPARα signal pathway and non-alcoholic steatohepatitis[J].ShandongMedicalJournal, 2016, 56(8):98-100.

[14] DIOT C, DOUAIRE M. Characterization of a cDNA sequence encoding the peroxisome proliferator activated receptor alpha in the chicken[J].PoultSci, 1999, 78(8):1198-1202.

[15] 熊 敏. PPARs調(diào)控家禽脂肪代謝的基因網(wǎng)絡(luò)研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

XIONG M. Gene regulatory networks of PPARS on pourtry lipid metabolism[D]. Wuhan:Huazhong Agricultural University,2011.

[16] MAKIA N L, GOLDSTEIN J A. CYP2C8 is a novel target of peroxisome proliferator-activated receptor α in human liver[J].MolPharmacol, 2016, 89(1):154-164.

[17] LI H, WANG T, XU C, et al. Transcriptome profile of liver at different physiological stages reveals potential mode for lipid metabolism in laying hens[J].BMCGenomics, 2015, 16(1):1-13.

[18] SCHNEIDER W J. Lipid transport to avian oocytes and to the developing embryo[J].JBiomedRes, 2016, 30(3):174-180.

[19] WILLIAMS J, HARVEY S, LECLERCQ B. Plasma levels of luteinizing hormone, growth hormone, and estradiol from six weeks of age to sexual maturity in two lines of chickens selected for low or high abdominal fat content[J].PoultSci,1986, 65(9):1782-1786.

[20] TANABE Y, NAKAMURA T, TANASE H, et al. Comparisons of plasma LH, progesterone, testosterone and estradiol concentrations in male and female chickens (Gallusdomesticus) from 28 to 1141 days of age[J].EndocrinolJpn, 1981, 28(5):605-613.

[21] BUTLER E J. Lipid metabolism in the fowl under normal and abnormal circumstances[J].ProcNutrSoc, 1975, 34(1):29-34.

[22] SAARELA J, JUNG G, HERMANN M, et al. The patatin-like lipase family inGallusgallus[J].BMCGenomics, 2008, 9(1):1-15.

[23] SPEAKE B K, MURRAY A M, NOBLE R C. Transport and transformations of yolk lipids during development of the avian embryo[J].ProgLipidRes, 1998, 37(1):1-32.

[24] HERMIER D, CATHELINE D, LEGRAND P. Relationship between hepatic fatty acid desaturation and lipid secretion in the estrogenized chicken[J].CompBiochemPhysiolAPhysiol, 1996, 115(3):259-264.

[25] WILLIAMS J, HARVEY S. Plasma concentrations of luteinizing hormone growth hormone, oestradiol, testosterone and androstenedione in the domestic hen from 6 weeks of age to sexual maturity[J].ReprodNutrDev, 1986, 26(2A):515-522.

[26] KLEIN-HITPASS L, SCHORPP M, WAGNER U, et al. An estrogen-responsive element derived from the 5' flanking region of the xenopus vitellogenin A2 gene functions in transfected human cells[J].Cell, 1986, 46(7):1053-1061.

[27] KLEIN-HITPASS L, RYFFEL G U, HEITLINGER E, et al. A 13 bp palindrome is a functional estrogen responsive element and interacts specifically with estrogen receptor[J].NucleicAcidsRes, 1988, 16(2):647-663.

[28] ZHOU H B, CARLSON K E, STOSSI F, et al. Analogs of methyl-piperidinopyrazole (MPP): antiestrogens with estrogen receptor alpha selective activity[J].BioorgMedChemLett, 2009, 19(1):108-110.

[29] BORD S, HORNER A, BEAVAN S, et al. Estrogen receptors alpha and beta are differentially expressed in developing human bone[J].JClinEndocrinolMetab, 2001, 86(5):2309-2314.

[30] 李 軍. 海蘭蛋雞和振寧土雞間卵黃生成的比較及雌激素對(duì)卵黃蛋白生成的調(diào)節(jié)作用[D]. 杭州：浙江大學(xué), 2014.

LI J. A comparative study of yolk synthesis between Hyline and Zhenning layers and stimulation of 17β-estradiol on yolk proteins synthesis[D]. Hangzhou:ZhejiangUniversity,2014.

[31] HARRINGTON W R, SHENG S, BARNETT D H, et al. Activities of estrogen receptor alpha- and beta-selective ligands at diverse estrogen responsive gene sites mediating transactivation or transrepression[J].MolCellEndocrinol, 2003, 206(1-2):13-22.

[32] MATTSSON A, OLSSON J A, BRUNSTROM B. Activation of estrogen receptor alpha disrupts differentiation of the reproductive organs in chicken embryos[J].GenCompEndocrinol, 2011, 172(2):251-259.

[33] KOLKOVA Z, CASSLEN V, HENIC E, et al. The G protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER/GPR30) does not predict survival in patients with ovarian cancer[J].JOvarianRes, 2012, 5(1):1257-1261.

[34] MENENDEZ D, INGA A, RESNICK M A. Estrogen receptor acting in cis enhances WT and mutant p53 transactivation at canonical and noncanonical p53 target sequences[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2010, 107(4):1500-1505.

[35] TORAN-ALLERAND C D. Novel sites and mechanisms of oestrogen action in the brain[J].NovartisFoundSymp, 2000, 230(230):56-73.

(編輯 程金華)

Expression of CYP2C8 Is Regulated by Estrogen through ER-α in Liver of Chicken

LI Yan-min, LI Cui-cui, ZHENG Hang, TIAN Fang-yuan, WANG Tai-an,TIAN Ya-dong, LI Zhuan-jian, KANG Xiang-tao,LIU Xiao-jun*

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University,HenanInnovativeEngineeringResearchCenterofPoultryGermplasmResource,InternationalJointResearchLaboratoryforPoultryBreedingofHenan,Zhengzhou450002,China)

The objectives of the present study were to investigate the characteristics of expression and regulation ofCYP2C8 gene in chicken. A total of 14 tissues (including heart, liver, spleen, lung, kidney, pectoral muscle, abdominal fat, gizzard, glandular stomach, ovaries, pancreas, duodenum, jejunum and ileum) were collected from Lushi green-shelled-egg chickens at the age of 30 weeks old, and the liver tissues were obtained from the chickens at different development stages (from the age of 1 day to 30 weeks old) . The samples were used to detect the spatiotemporal expression profiles ofCYP2C8 gene using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technology. In addition, the pullets (at the age of 10 weeks old) which were treated with 17β-estradiol, and chicken embryo primary hepatocytes which were treated with either 17β-estradiol alone or combination of 17β-estradiol and estrogen receptor (ER) antagonists were used to analysis the expression regulation mechanism of theCYP2C8 gene. The results showed thatCYP2C8 gene was expressed extensively in different tissues of chicken. The relative expression level ofCYP2C8 was higher in the main lipid metabolism tissues such as liver, kidney, and small intestine (duodenum, jejunum and ileum) than that in other tissues. The expression level ofCYP2C8 gene in liver of hens was significantly increased with the sexual maturity (P<0.01). Estrogen could significantly up-regulate the expression ofCYP2C8 in liver of chicken and hepatocytes (P<0.05). MPP, as an ER-α specific antagonist, could completely antagonize the expression ofCYP2C8 gene (P<0.05). Therefore we concluded thatCYP2C8 gene was expressed extensively in different tissues with higher expression levels in liver, kidney, and small intestine (duodenum, jejunum, and ileum) tissues, and the highest expression level in liver. It was suggested that the effect of estrogen on the expression ofCYP2C8 gene was predominantly mediated via ER-α in the chicken liver.

liver;CYP2C8 gene; expression regulation; estrogen

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.12.005

2016-06-06

河南省國際合作項(xiàng)目(162102410030)；地方雞種質(zhì)資源保護(hù)與利用教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1236)；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系遺傳育種崗位專項(xiàng)資金(CARS-41-K04)

李艷敏(1989-)，女，河南尉氏人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：15138656629@163.com

*通信作者：劉小軍，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：xjliu2008@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2016)12-2362-08