馮 園， 郭大志， 潘樹義

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高壓氧對腦白質(zhì)疏松大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

馮 園1,2， 郭大志2， 潘樹義2

目的 探討高壓氧對腦白質(zhì)疏松大鼠的行為學(xué)、海馬結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元影響。方法 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制作缺血缺氧腦白質(zhì)疏松模型，術(shù)后2 w腦白質(zhì)疏松形成。第15天起給予2.0ATA的壓力治療1 h/d，共14 d。定位航行實(shí)驗(yàn)、足跡實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化，HE染色觀察大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，TUNEL法觀察凋亡神經(jīng)元情況。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，手術(shù)組及高壓氧治療組大鼠認(rèn)知功能明顯減弱，神經(jīng)元數(shù)量減少,排列疏松,胞核固縮，TUNEL陽性細(xì)胞增多;與手術(shù)組比較，高壓氧組認(rèn)知功能有所改善，神經(jīng)元數(shù)量多且排列整齊。TUNEL法測高壓氧組神經(jīng)元凋亡情況改善。結(jié)論 高壓氧可改善腦白質(zhì)疏松大鼠海馬結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元凋亡情況，且有助于其認(rèn)知功能的恢復(fù)。

腦白質(zhì)疏松； 高壓氧； 腦白質(zhì)損傷; 定位航行實(shí)驗(yàn)

高壓氧(Hyperbaric oxygen，HBO)治療是最早由潛水和高氣壓醫(yī)學(xué)會(huì)定義的一種治療方法，指在高于一個(gè)大氣壓的加壓艙內(nèi)呼吸100%純氧的治療過程，也是目前廣泛應(yīng)用于臨床的一種無創(chuàng)療法。其作用機(jī)制主要是通過增加周圍環(huán)境中的大氣壓和氧分壓來提高氧分子在組織內(nèi)的彌散距離，使氧與組織充分接觸，改善微環(huán)境[1]。此外，高壓氧還可通過增加傷口周圍的氧梯度加速其愈合，并促進(jìn)氧依賴膠原蛋白基質(zhì)形成，進(jìn)而加快血管新生[2]。Lavrnja等人近期的研究表明,HBO能夠抑制腦損傷后炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，防止星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少膠質(zhì)瘢形成[3]。

腦白質(zhì)疏松癥(Leukoaraiosis,LA)是一個(gè)影像學(xué)術(shù)語，用于描述腦室周圍及半卵圓中心區(qū)腦白質(zhì)在CT的彌漫性低密度影或MRI T2加權(quán)像的高密度影表現(xiàn)，常兩側(cè)對稱，病理表現(xiàn)為少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，髓鞘脫失及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等，臨床出現(xiàn)認(rèn)知障礙和步態(tài)異常等癥狀，引起腦白質(zhì)疏松的原因包括腦外傷、一氧化碳中毒、阿爾茨海默病等，但目前臨床上最為常見的原因是持續(xù)低灌注引起的缺血缺氧，長期低灌注致使大腦深部白質(zhì)發(fā)生缺血性脫髓鞘改變，最終造成腦白質(zhì)疏松。為研究高壓氧治療對腦白質(zhì)疏松的影響，我們采用de la Torre JC[4]的雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法，制作缺氧缺血腦白質(zhì)疏松模型，探討高壓氧治療腦白質(zhì)疏松的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)動(dòng)物及分組：2～3 m的Sprague-Dawly雄性大鼠60只，體重200 g左右(由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為3組：其中包括假手術(shù)組(n=20)、手術(shù)組(n=20)、HBO治療組(n=20)。(2)器材：單人純氧艙(NG90-ⅢBd 單人醫(yī)用高壓氧艙，寧波高壓氧艙總廠生產(chǎn))，水迷宮(ZS-001 Morris水迷宮，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn))。

1.2 動(dòng)物模型制備 術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射，保證術(shù)間自主呼吸，大鼠仰臥位固定，頸部備皮，酒精消毒后延頸部正中線做縱行切口，切口約2～3 cm，從胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌交界處鈍性分離，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈與交感神經(jīng)鏈，玻璃分針剝離交感神經(jīng)，用4-0號(hào)線結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，1-0號(hào)線縫合肌肉和皮膚。傷口消毒后，無菌紗布覆蓋。假手術(shù)組僅頸部切開，分離出頸總動(dòng)脈后不結(jié)扎。術(shù)后放至37 ℃恒溫箱中，至大鼠蘇醒后放置通風(fēng)條件良好的動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.3 HBO治療 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎14 d后，腦白質(zhì)疏松形成。此后HBO治療組大鼠行高壓氧治療，治療壓力為2.0 ATA，氧氣洗艙時(shí)間10 min，加壓時(shí)間15 min，穩(wěn)壓吸氧60 min，減壓時(shí)間15 min，艙內(nèi)溫度(23.3±2)℃。一次/d，共14次。

1.4 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)主要用于檢測動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[5]，各組大鼠造模前訓(xùn)練3 d，將大鼠頭部朝上，面向池壁放入水中，如果大鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留20 s記憶平臺(tái)位置。如果60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，用棒將其引至平臺(tái)并停留20 s。每只大鼠依次從4個(gè)象限的入水點(diǎn)入水中，4個(gè)象限完成后擦干，電熱扇保溫后放入籠中。造模完成14 d后，大鼠腦白質(zhì)疏松形成，術(shù)后第15天、第16天、第17天、第21天、第28天行定位航行試驗(yàn)，將大鼠面壁放入水中，記錄60 s內(nèi)找到平臺(tái)時(shí)間，即為逃避潛伏期。若未找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為60 s，分別從4個(gè)象限放入，4個(gè)象限的平均值為平均逃避潛伏期。

1.4.2 足跡實(shí)驗(yàn) 自制一U型通道，長寬高分別為60 cm、7 cm、6 cm。通道底部鋪同樣長寬的白紙，大鼠兩前足沾藍(lán)色墨汁，兩后足沾紅色墨汁，將大鼠放于通道入口端，記錄通過通道到達(dá)另一端時(shí)留下的足跡個(gè)數(shù)，測量總路長，計(jì)算平均步長。術(shù)后14 d給予高壓氧治療，治療7 d(即術(shù)后21 d)、14 d(術(shù)后28 d)后分別行足跡實(shí)驗(yàn)。

1.5 取材及HE染色 將行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后的大鼠麻醉,剪開胸廓，經(jīng)心臟灌注取腦，4%多聚甲醛固定，梯度脫水后石蠟包埋,行4 μm連續(xù)冠狀切片。取相同位置腦片(包含海馬)進(jìn)行常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 TUNEL又稱脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法，是一項(xiàng)用于檢測凋亡細(xì)胞的技術(shù)。石蠟組織切片，按照試劑盒說明書依次浸洗、染色。光鏡下觀察側(cè)腦室旁神經(jīng)元的凋亡情況，并選取多視野計(jì)數(shù)凋亡神經(jīng)元情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測量方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。TUNEL陽性細(xì)胞采用單因素方差分析結(jié)合SNK法比較各組間的差異，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 假手術(shù)組、手術(shù)組、HBO治療組進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，各組隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，逃避潛伏期均縮短。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組和HBO治療組平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；術(shù)后21～28 d，HBO治療組較手術(shù)組明顯縮短(P<0.05)(見表1)。

2.2 足跡實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組在手術(shù)前平均步長無差異。術(shù)后21 d，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，手術(shù)組和治療組動(dòng)物步態(tài)凌亂，步數(shù)增加，平均步長顯著縮短。術(shù)后28 d，HBO治療組較手術(shù)組步伐凌亂得到明顯改善，平均步長較模型組增加，與假手術(shù)組相當(dāng)(見表2)。

2.3 HE染色 光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)可見，假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊、緊密，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)染色均勻。手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，排列疏松，胞核固縮、碎裂或溶解，胞漿周圍可見空暈,胞間距較大。HBO治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較手術(shù)組數(shù)量多，排列較密，染色清晰且固縮變性的神經(jīng)元較少(見圖1)。

2.4 大鼠神經(jīng)元凋亡的比較 TUNEL陽性細(xì)胞為凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞，胞體及細(xì)胞核固縮深染，胞核棕黃色，表現(xiàn)出凋亡特征。正常神經(jīng)元細(xì)胞呈藍(lán)黑色。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠側(cè)腦室旁可見，假手術(shù)組大鼠側(cè)腦室旁只有零星的凋亡神經(jīng)元；手術(shù)組見大量凋亡神經(jīng)元；HBO治療組凋亡神經(jīng)元較手術(shù)組組明顯減少(見圖2)。

2.5 圖像處理與分析 光鏡下觀察各組切片，采用圖像處理與分析系統(tǒng)分析每張照片，觀察每張切片的5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠側(cè)腦室凋亡神經(jīng)元數(shù)比較，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組與HBO治療組凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.05)；與手術(shù)組相比，HBO治療組經(jīng)HBO治療后凋亡細(xì)胞減少(P<0.05)。

表1 高壓氧對腦白質(zhì)疏松大鼠平均逃避潛伏期的影響(單位：s， ±s)

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與手術(shù)組相比#P<0.05

表2 高壓氧對腦白質(zhì)疏松大鼠足跡測試的影響(單位:cm， ±s)

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與手術(shù)組相比#P<0.05

A:假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊、緊密，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)染色均勻;B:手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，排列疏松，胞核固縮、碎裂或溶解，胞漿周圍可見空暈,胞間距較大;C:HBO治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較手術(shù)組數(shù)量多，排列較密，染色清晰且固縮變性的神經(jīng)元較少

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)(HE染色，×200)

A:假手術(shù)組大鼠側(cè)腦室旁只有零星的凋亡神經(jīng)元； B:手術(shù)組見大量凋亡神經(jīng)元；C: HBO治療組凋亡神經(jīng)元較手術(shù)組組明顯減少

圖2 大鼠側(cè)腦室旁神經(jīng)元凋亡比較(TUNEL染色，×200)

3 討 論

腦白質(zhì)疏松又稱為腦小血管病，是現(xiàn)在公認(rèn)的腦小血管病理表現(xiàn)[6]，其與動(dòng)脈粥樣硬化和淀粉樣變是老年性腦改變中最常見的退行性血管疾病。腦小血管病的病理生理機(jī)制尚不完全明確，但內(nèi)皮功能障礙在引起腦小血管缺血方面起著重要作用[7]。在老年人的頭部CT或MRI檢查中經(jīng)?？梢钥吹侥X白質(zhì)疏松改變，尤其是伴有血管危險(xiǎn)因素的老年患者[8]。臨床上常表現(xiàn)為卒中和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加及認(rèn)知能力下降[7]，且認(rèn)知功能下降和致殘率升高的程度是一致的[9]。腦白質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素包括：年齡、性別、種族、高血壓、糖尿病、抽煙、大血管動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心臟病、基因等[7]。因腦白質(zhì)疏松的最重要原因是腦血管供血不足，所以本文采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法，模擬大鼠缺血缺氧后低灌注引起的腦白質(zhì)損害。

HBO治療可明顯提高動(dòng)脈血氧分壓及氧含量[10,11]，提高機(jī)體內(nèi)氧的攝取，增加氧分子彌散距離。對于創(chuàng)傷性腦損傷，HBO還可減少急性期炎癥因子的產(chǎn)生及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]，增強(qiáng)血腦屏障的穩(wěn)定性，降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫[13,14]。對于腦缺血性損傷，HBO可以顯著減少低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)及其下游效應(yīng)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[15]，還可以顯著改善腦血流量，促進(jìn)微循環(huán)和側(cè)枝循環(huán)[16]。

海馬在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮著重要作用，有研究表明大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈永久性結(jié)扎可引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)元減少，且慢性認(rèn)知功能障礙[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示水迷宮、足跡實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)術(shù)后15～17 d手術(shù)組和HBO治療組較假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05);術(shù)后21～28 d較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明手術(shù)組較HBO治療組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，且手術(shù)組大鼠足跡紊亂，步長顯著縮短(P<0.05)。手術(shù)組較HBO治療組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色神經(jīng)元凋亡較多、排列紊亂,與以前的研究結(jié)果一致[17]。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)HBO治療組較手術(shù)組大鼠側(cè)腦室旁凋亡神經(jīng)元減少，證實(shí)了HBO治療可減輕神經(jīng)元凋亡情況。本實(shí)驗(yàn)證明，HBO治療通過抑制海馬區(qū)及側(cè)腦室旁神經(jīng)元的凋亡而對腦白質(zhì)疏松大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。

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The neuroprotection effect of hyperbaric oxygen on rats with leukoaraiosis

FENGYuan，GUODazhi，PANShuyi.

(ThethirdClinicalMedicalSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China)

Objective To explore the effect of hyperbaric oxygen on the behavior of leukoaraiosis rat and its hippocampus structure and neurons.Method Established a model of cerebral white matter injure by ligation both of the commom carotid carotid artery combined with hypoxia,the leukoaraiosis formed two weeks ago.From the 15th day,the rats were given 1.6ATA hyperbaric oxygen treatment，one time a day for 14 days.Observed the the behavior changes of rats through the place Navigation experiment and footprint test experiment.HE staining was used to observe the morphological changes of neurons in rat.Apoptosis neurons were observed by TUNEL.Results Compared with the control group,the cognitive function of rat in surgery group and HBO treatment group decreased significantly.The number of neurons decreased,arranged loosely,nucleus pycnosis,TUNEL positive cells increased.Compared with the surgical,HBO group improved cognitive function,neurons increased and rows neat and apoptotic neurons decreased.Conclusion HBO improves hippocampal formation and neuronal apoptosis in leukoaraiosis rats,and was helpful to the recovery of cognitive function.

Leukoaraiosis; Hyperbaric oxygen; White matter impact; Place Navigation experiment

1003-2754(2016)12-1107-04

2016-08-15；

2016-11-30 作者單位：(1．南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515; 2．中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京100048) 通訊作者：潘樹義，E-mail：psy9992011@163.com

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