侯 亮， 徐 芳， 劉學(xué)春， 汪青松

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人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦梗死大鼠外周血Foxp3表達(dá)的影響

侯 亮， 徐 芳， 劉學(xué)春， 汪青松

目的 探討人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)移植對腦梗死大鼠外周血Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞改善缺血性腦損害的可能機(jī)制。方法 選擇SD大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、生理鹽水組、MSC組，每組10只。各組大鼠分別測定1 d、7 d、14 d、28 d外周血單個核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)和神經(jīng)功能缺損評分；TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)。結(jié)果 MSC組14 d、28 d神經(jīng)功能缺損評分明顯低于對照組及生理鹽水組[(6.1±1.4)分 vs (7.3±1.1)分，(7.3±0.9)分；(5.2±1.0)分 vs (6.2±1.0)分，(6.3±0.5)分；P<0.05]； 28 d凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組及生理鹽水組(P<0.05)。對照組、生理鹽水組及MSC組1 d、7 d、14 d、28 d外周血Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 MSC組1 d、7 d外周血Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于對照組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MSC移植改善大鼠急性腦缺血神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制之一,可能與上調(diào)免疫炎性反應(yīng)初期Foxp3 mRNA表達(dá)有關(guān)。

間充質(zhì)干細(xì)胞； 腦梗死； Foxp3

腦梗死因其致殘率、病死率高，易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),是嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病。近年來重組組織型纖溶酶原激活劑的應(yīng)用在溶栓治療方面取得了很大的進(jìn)展，然而，由于溶栓治療時間窗較短(僅有6 h)，只有極少部分患者能從中受益，因此尋求一種新的、不受時間限制的方法治療腦卒中尤為重要。目前，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的新型治療策略已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外大量動物實(shí)驗(yàn)和部分臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，無論是機(jī)體自身干細(xì)胞、祖細(xì)胞的動員、募集，還是自體或異體干細(xì)胞移植，能顯著改善受損的神經(jīng)功能。經(jīng)研究證實(shí),人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)能分化成為包括少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種類型細(xì)胞，從而使人臍帶血MSC治療腦卒中成為可能[1]。然而MSC通過何種或哪些途徑改善受損神經(jīng)功能尚不明了[2]。本實(shí)驗(yàn)通過對人臍帶血MSC移植后腦缺血大鼠靜脈血Foxp3表達(dá)的動態(tài)監(jiān)測，探討人臍帶血MSC改善大鼠缺血性腦損傷的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 清潔級成年SD雄性大鼠40只，7～8 w齡，體質(zhì)量250～300 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物房。自由飲食,室溫控制在(23±3)℃,每日光照12 h、黑暗12 h，術(shù)前隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、生理鹽水組、MSC組，每組10只。

1.2 人臍帶血MSC的分離和培養(yǎng)及鑒定 人臍血MSC的分離和培養(yǎng)：健康足月剖宮產(chǎn)新生嬰兒臍帶血40份，標(biāo)本由本院婦產(chǎn)中心提供，產(chǎn)婦及家屬均簽署知情同意書。術(shù)前行感染免疫九項(xiàng)檢查(乙肝五項(xiàng)、癌胚抗原、甲胎蛋白、梅毒血清特異性抗體測定、結(jié)核桿菌抗體試驗(yàn))及常規(guī)檢查，排除梅毒、艾滋病、肝炎等傳染性疾病的可能，無菌條件下采集臍帶血，由解放軍105醫(yī)院細(xì)胞生殖中心分離培養(yǎng)人臍帶血MSC以備用。

1.3 大鼠大腦中動脈缺血模型的建立和干預(yù) 采用改良線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血模型,造模前12 h大鼠禁食但不禁水，3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，置于操作臺上，保溫：60瓦白熾燈37 cm，高度直接照射，可使肛溫保持在37 ℃。電子體溫計(jì)監(jiān)測肛溫,維持在(37±0.5)℃，頸部正中切口長2～3 cm，分離右頸總動脈，動脈夾于頸內(nèi)動脈根部遠(yuǎn)端5 mm處夾閉，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈根部遠(yuǎn)端5 mm處，頸內(nèi)動脈根部剪一斜形小口，插入經(jīng)處理過的0.8號漁線，結(jié)扎頸內(nèi)動脈，剪斷漁線殘端,縫合皮膚，栓塞2 h。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：提大鼠尾部，使其懸空， 30 s內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)頸超過10°，左前肢(腦缺血對側(cè))屈曲內(nèi)收，肌張力下降，爬行時呈典型追尾征，若無此典型癥狀予以剔除。大腦中動脈缺血模型制備成功后10 min，收集人臍帶血MSC生理鹽水稀釋液1 ml (1×106細(xì)胞)，經(jīng)尾靜脈注射到MSC組大鼠體內(nèi)，將等量生理鹽水通過尾靜脈注射到生理鹽水組大鼠體內(nèi)。對照組僅建立模型，假手術(shù)組僅分離出頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分 3組大鼠模型制備后1 d、7 d、 14 d、28 d采用改良的神經(jīng)功能缺損評分分別進(jìn)行盲評，共18分，其中1～6分為輕度神經(jīng)功能缺損；7～12分為中度神經(jīng)功能缺損；13～18分為重度神經(jīng)功能缺損[3]。

1.5 外周血Foxp3的表達(dá) 人臍帶血MSC注射成功后1 d、7 d、14 d、28 d分別抽取各組大鼠尾靜脈血0.1 ml，肝素抗凝。TRZzol一步法提取總RNA。按照說明書步驟操作，紫光分光光度計(jì)測其濃度并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,膠回收法純化DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。熒光RT-PCR法測定外周血單個核細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)，并以U6和β肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參物，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其相對表達(dá)量的U6和β-actin校正值。

1.6 TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測 對照組、生理鹽水組、MSC組各取10只大鼠分別于再灌注28 d再次麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注固定，分別于每例切片的缺血區(qū)取腦，10%甲醛溶液固定，制備5 mm厚的石蠟切片。常規(guī)脫蠟至水，按照試劑說明書操作，對氨基聯(lián)苯胺顯色、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。在顯微鏡200倍視野下細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。缺血區(qū)連續(xù)拍攝6張照片，并計(jì)算TUNEL陽性凋亡細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較 MSC組、對照組和生理鹽水組1 d、7 d神經(jīng)功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MSC組14 d、28 d神經(jīng)功能缺損評分明顯低于對照組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，見表1)。

2.2 各組不同時間點(diǎn)外周血Foxp3 mRNA表達(dá)比較 對照組、生理鹽水組及MSC組1 d、7 d、14 d、28 d 外周血Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。 MSC組1 d、7 d外周血Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于對照組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 各組大鼠28 d凋亡細(xì)胞數(shù)的比較 光鏡下可見，假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)僅有少數(shù)或無凋亡細(xì)胞。生理鹽水組、對照組可見大量棕黃色凋亡細(xì)胞。假手術(shù)組、對照組、生理鹽水組和MSC組28 d凋亡細(xì)胞數(shù)分別為(1.50±1.08)個、(9.80±2.57)個、(10.10±2.33)個和(7.60±1.43)個。假手術(shù)組和MSC組28 d凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1～圖4)。

表1 各組不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較±s，n=10)

與對照組比較*P<0.05；與生理鹽水組比較△P<0.05

表2 各組不同時間點(diǎn)外周血Foxp3 mRNA表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較*P<0.01；與對照組比較△P<0.05；與生理鹽水組比較#P<0.05

3 討 論

近些年中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中，細(xì)胞移植物的來源主要有神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎組織細(xì)胞，但由于供體來源困難、法律上和倫理學(xué)存在異議、免疫排斥反應(yīng)、移植細(xì)胞存活困難等問題導(dǎo)致發(fā)展空間有限。人臍帶血MSC具有全能干細(xì)胞的特點(diǎn)，一定條件下可跨胚層橫向分化，與骨髓比較，臍血來源更充足，臍血免疫原性較弱，能耐受更大程度的人類白細(xì)胞抗原配型不符，并且來源豐富、易于采集、保存方便、傳代穩(wěn)定，因此可作為一種新的替代細(xì)胞來源用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療[4]。國內(nèi)外研究表明,人臍帶血MSC經(jīng)體循環(huán)遷移至腦損傷區(qū)域并存活，分化為神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)受損的神經(jīng)功能恢復(fù)[5～8]。炎性反應(yīng)在急性腦缺血后的腦損傷中起到非常重要的作用[9,10]。CD4、CD25 T細(xì)胞在此過程中可抑制促炎性因子表達(dá)的上調(diào)及阻止淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及對大腦的損害，從而減輕腦組織免疫損傷的發(fā)生，而CD4、CD25 T細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個重要亞群,具有免疫抑制性和免疫無能性兩大功能特征,由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的抗炎細(xì)胞因子在抑制免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它們可以抑制TNF-α、IFNγ和白細(xì)胞介素-6的神經(jīng)毒性作用，可減弱缺血性腦卒中所致的炎性反應(yīng)，減輕血腦屏障的損傷，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和神經(jīng)保護(hù)的功能，F(xiàn)oxp3可作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異分子標(biāo)記物[11～16]。它的表達(dá)是該細(xì)胞發(fā)揮功能的前提。

本研究大腦中動脈缺血模型制作成功后，對照組、生理鹽水組及MSC組外周血Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，說明急性腦缺血可引起免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而誘導(dǎo)Foxp3 mRNA表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮其免疫抑制作用。MSC組1 d、7 d Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于對照組及生理鹽水組，說明急性腦缺血初期人臍帶血MSC可更明顯的抑制免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。人臍帶血MSC移植后28 d，MSC組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組及生理鹽水組，且神經(jīng)功能缺損評分明顯低于對照組及生理鹽水組，說明Foxp3 mRNA表達(dá)增高與神經(jīng)功能恢復(fù)相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)oxp3參與了急性腦缺血的病理生理過程，在急性腦缺血后抑制免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生以及促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用， MSC移植改善大鼠急性腦缺血神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制之一，可能與上調(diào)炎癥初期Foxp3 mRNA的表達(dá)有關(guān)。

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Effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation on Foxp3 expression in peripheral blood of errebral infarction rats

HOULiang,XUFang,LIUXuechun,etal.

(DepartmentofNeurology,ChinesePLACollegeofClinicalMedicine,Hefei230031,China)

Objective To explore the possible mechanisms of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (hUCB-MSCs) transplantation on improving ischemic brain damage,Foxp3 expression in peripheral blood was observed in rats following focal cerebral ischemia reperfusion (I/R).Methods 40 healthy SD rats were randomly divided into sham operation group,I/R group,saline group and hUCB-MSCs group.Foxp3 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells and modified neurological severity score(mNSS) were measured 1 d,7 d,14 d and 28 d after reperfusion.Neural cell apoptosis was detected by TUNEL 4 w after reperfusion.Results mNSS in hUCB-MSCs group 14 d and 28 d after reperfusion was significantly lower than that of control group and saline group[(6.1±1.4) points vs (7.3±1.1) points，(7.3±0.9) points;(5.2±1.0) points vs (6.2±1.0) points，(6.3±0.5) points;P<0.05].The number of neural cell apoptosis in hUCB-MSCs was obviously less than that of control group and saline group 28 d after reperfusion (P<0.05).Foxp3 mRNA expression level in hUCB-MSCs group was significantly higher than that of control group and saline group 1 d and 7 d after reperfusion (P<0.05).Conclusion Up-regulation of Foxp3 mRNA expression is one of the possible mechanisms of hUCB-MSCs transplantation on improving ischemic brain damage the mechanisms of inhibiting inflammatory reaction.

Mesenchymal stem cells; Brain infarction; Foxp3

圖1 假手術(shù)組

圖3 生理鹽水組

圖2 對照組

圖4 MSC組

1003-2754(2016)12-1060-04

2016-10-06；

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金(No.81171108)；南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(No.14MS039)

(安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院第一0五醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

汪青松，E-mail：wangqs65@yahoo.com

R743.3

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