牛繼偉，孫曉軍，孟曉琴，汪占弟，馬莉萍

(蘭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730050)

甘肅省首屆獸醫(yī)系統(tǒng)征文選登

Masson-Fontana銀染色法改良研究

牛繼偉，孫曉軍，孟曉琴，汪占弟，馬莉萍

(蘭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730050)

為簡(jiǎn)化常規(guī)Masson-Fontana染色法顯示嗜銀細(xì)胞的染色流程、縮短染色時(shí)間，并獲得良好染色效果，通過研究對(duì)改變影響染色效果最為關(guān)鍵的氨銀溶液濃度、浸染溫度和時(shí)間等因素對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，探索出在60℃水浴中用2.5%氨銀溶液浸染石蠟切片1 h能得到較好的染色效果，嗜銀細(xì)胞著色深淺適宜，背景較淺，嗜銀顆粒清晰可辨，細(xì)胞核明顯。說(shuō)明改良后的Masson-Fontana銀染法更為便捷，可以用于嗜銀細(xì)胞的染色。

嗜銀細(xì)胞；Masson-Fontana；銀染色法

胃腸道黏膜中散在著多種內(nèi)分泌細(xì)胞，它們具有共同的細(xì)胞化學(xué)特點(diǎn)，都具有產(chǎn)生胺類和肽類激素的功能[1-3]。由于這些細(xì)胞產(chǎn)生的胺類和肽類激素都貯存在胞漿中的分泌顆粒中，可以采用組織化學(xué)染色中的親銀和嗜銀染色來(lái)顯示，因此這些細(xì)胞通常都被稱為嗜銀細(xì)胞[4]。目前主要采用免疫組化或特殊的銀染方法來(lái)顯示這些細(xì)胞。然而，從經(jīng)濟(jì)角度、操作的簡(jiǎn)易程度及染色的綜合效果來(lái)看，特殊的銀染方法仍不失為一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便而又實(shí)用的顯示方法，受到了廣大科研工作者的普遍認(rèn)可。在眾多的銀染色法中，Masson-Fontana銀染色法以其結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定、非特異性著色少等特點(diǎn)而被廣泛使用[5-7]。然而，常規(guī) Masson-Fontana染色法顯示嗜銀細(xì)胞時(shí)需要在氨銀溶液中浸染12～18 h或更長(zhǎng)時(shí)間[8-9]，這樣不僅耗時(shí)，而且也會(huì)增加掉片的幾率。

1 材料與方法

1.1 切片標(biāo)本的制備

健康雙峰駝皺胃賁門腺區(qū)新鮮組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片。

1.2 氨銀溶液的配制

取10%硝酸銀水溶液20 mL，逐滴加入濃氨水，邊加邊搖晃，直到產(chǎn)生的沉淀逐漸溶解為止，再滴加10%硝酸銀水溶液數(shù)滴至溶液呈輕度混濁為度。此溶液可短期保存，但最好臨用前現(xiàn)配制。使用前稀釋成合適濃度過濾后使用。為摸索出氨銀溶液的最佳工作濃度，本實(shí)驗(yàn)中將此溶液分別用蒸餾水稀釋成5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%5個(gè)濃度進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水洗，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將第一批切片入以上不同濃度氨銀溶液，置于室溫下避光浸染18 h，蒸餾水洗，加0.2%氯化金水溶液調(diào)色2～3 s，蒸餾水洗，再入5%硫代硫酸鈉水溶液固定5 min，用蒸餾水洗，Van Gieson氏染液復(fù)染1～2 min，95%乙醇急速分化數(shù)秒，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察；第二批切片入預(yù)熱至40℃或60℃的不同濃度氨銀溶液中，分別進(jìn)行30 min，1～2 h避光浸銀反應(yīng)，試圖找到最佳浸銀反應(yīng)濃度、溫度和時(shí)間，其他步驟同第一批。

2 結(jié)果

2.1 氨銀溶液的濃度對(duì)浸銀染色的影響

不論是用常規(guī)Masson-Fontana染色法，還是用經(jīng)過改良的染色法，2.5%的氨銀溶液染色效果較好，背景較淺，細(xì)胞著色深淺適宜，嗜銀顆粒清晰可辨，細(xì)胞核也明顯可見。高倍鏡下可見胃賁門腺腺體中的嗜銀細(xì)胞主要位于腺體基部的腺體細(xì)胞之間，胞漿中有大量的分泌顆粒被還原的銀鹽染成棕黑色，細(xì)胞大多單個(gè)夾于其他上皮細(xì)胞之間，呈不規(guī)則的錐體形、圓形或梭形，胞核圓形，位于細(xì)胞中央或一側(cè)（見圖1）。

圖1 2.5%氨銀溶液60℃避光作用1 h后胃賁門腺內(nèi)的嗜銀細(xì)胞(改良Masson-Fontana銀染色法，×400)

2.2 氨銀溶液溫度和浸染時(shí)間對(duì)染色效果的影響

研究發(fā)現(xiàn)，用預(yù)熱的氨銀溶液60℃避光作用1 h后，浸銀染色效果最佳。隨著溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，嗜銀細(xì)胞和背景組織著色太深，嗜銀顆粒相互融合，使得整個(gè)嗜銀細(xì)胞呈均質(zhì)的黑色，細(xì)胞核也不清楚（見圖2）。

3 討論

研究證實(shí)，在相同溫度和時(shí)間下，2.5%的氨銀溶液濃度染色效果較好，氨銀溶液濃度高于該濃度或是低于該濃度染色效果都不及該濃度染色效果好。氨銀溶液濃度高使得背景組織和嗜銀細(xì)胞著色太深，不易于觀察結(jié)果。氨銀溶液濃度低使得部分嗜銀細(xì)胞不能充分與氨銀溶液作用，導(dǎo)致著色率下降。2.5%的氨銀溶液染色效果較好，背景較淺，細(xì)胞著色深淺適宜，嗜銀顆粒清晰可見，細(xì)胞核也明顯可見。

圖2 2.5%氨銀溶液室溫下浸染18 h后胃賁門腺內(nèi)的嗜銀細(xì)胞(Masson-Fontana銀染色法，×400)

本研究中，用Van Gieson氏染液復(fù)染切片1～2 min，組織背景呈淡紅色，與黑色的嗜銀細(xì)胞形成明顯的對(duì)比和反差，與不復(fù)染的切片相比效果更佳，更易于觀察。

綜上所述，改良后的Masson-Fontana銀染法較傳統(tǒng)方法更省時(shí)省力，能夠得到滿意的染色效果，可以被廣泛用于科學(xué)研究和臨床檢測(cè)中。

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[本文獲甘肅省首屆獸醫(yī)系統(tǒng)征文比賽三等獎(jiǎng)]

（編輯：趙鵬飛）

R361.2

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1006-799X(2016)21-0015-02

牛繼偉（1981-），男，甘肅隴西人，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控研究。