1.濟(jì)南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 （山東 濟(jì)南 250022）

2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 （山東 濟(jì)南 250062）

3.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院骨三科 （天津 301700）

4.山東省立醫(yī)院 （山東 濟(jì)南 250021）

滕元偉1,2任秀智3王延宙4張宇昂1,2韓振忠1,2韓金祥2魯艷芹2

成骨不全14種長(zhǎng)鏈非編碼RNA差異表達(dá)分析*

1.濟(jì)南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 （山東 濟(jì)南 250022）

2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 （山東 濟(jì)南 250062）

3.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院骨三科 （天津 301700）

4.山東省立醫(yī)院 （山東 濟(jì)南 250021）

滕元偉1,2任秀智3王延宙4張宇昂1,2韓振忠1,2韓金祥2魯艷芹2

目的研究14種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）在成骨不全骨組織中的表達(dá)。方法采用先天性骻關(guān)節(jié)脫位患者骨組織作為對(duì)照，應(yīng)用RT-qPCR分析成骨不全骨組織中14種lncRNA(ATB、EBIC、HEIH、hLACR1、H0TAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC、LSINCTS 、Nbla10727、Nbla12061、PRNCR1與UC.388)的表達(dá)，使用REST-2009軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果與對(duì)照組相比，14種lncRNA中僅PRNCR1表達(dá)下調(diào)并具有顯著性差異；ATB、EBIC、H0TAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7種lncRNA表達(dá)差異均小于2倍，LSINCTS表達(dá)下調(diào)，HEIH、hLACR1、Nbla10727、Nbla12061與UC.388等5種lncRNA表達(dá)上調(diào)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論P(yáng)RNCR1在成骨不全骨組織中低表達(dá)，其在成骨不全疾病的功能尚有待于進(jìn)一步研究。

成骨不全；lncRNA；骨組織；PRNCR1

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度200～100,000個(gè)核苷酸的RNA，它們無(wú)編碼蛋白質(zhì)的能力或很少有編碼蛋白質(zhì)的能力[1]。lncRNA可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等途徑調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)[2]。

隨著人類基因組內(nèi)越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，lncRNA與神經(jīng)系統(tǒng)形成[3]、心血管形成[4]以及癌癥發(fā)生、發(fā)展[5]之間的關(guān)系也隨之被報(bào)道。并且，其表達(dá)水平與疾病的發(fā)生發(fā)展階段有緊密聯(lián)系[5]。成骨不全(osteogenesis imperfecta ,OI)是一類Ⅰ型膠原蛋白合成和代謝障礙引起的遺傳性結(jié)締組織病[6,7]。主要臨床表現(xiàn)為易骨折、骨質(zhì)疏松，部分患者會(huì)伴有藍(lán)鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、聽(tīng)力下降、肌肉薄弱、關(guān)節(jié)韌帶松弛等癥狀[8]。本研究擬分析14種長(zhǎng)鏈非編碼RNA在成骨不全患者骨組織中的差異表達(dá)，為研究骨相關(guān)lncRNA及其功能奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料液氮、無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、dNTP Mixture，10mM each(Takara)、Random Primers 50pM(Takara)、5×PrimeScript Buffer(Takara)、PrimeScript ⅡReverse Transcriptase 200U/ul(Takara)、DEPC、Trizol(Invitrogen)、SYBR Green熒光定量試劑盒(Roche)

1.2 方法經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)通過(guò)，本實(shí)驗(yàn)在天津市武清區(qū)人民醫(yī)院和山東省立醫(yī)院共收集被確診的成骨不全患者和先天性髖關(guān)節(jié)脫位患者術(shù)中廢棄的骨組織樣本各9例.其中，成骨不全患者平均年齡在7歲，5男4女。先天性骻脫位患者平均年齡6.8歲，5男4女。

1.2.1 骨組織總RNA提?。翰捎肨rizol試劑提取總RNA，RNase- free water溶解RNA，測(cè)定RNA純度和濃度，A260/A280比值均在1.8-2.0之間。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：采用兩步法，總反應(yīng)體系為20μL。第一步：反應(yīng)體系為10μL，其中RNA 2μg，Random Primers（50pM）1μL，dNTP Mixture(10mMeach)1μL，用RNase free water補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)程序：65℃ 5min，冰上急冷2min以上。第二步：Template RNA/Primer mixture 10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScriptⅡ Reverse Transcriptase(200U/ μL)1μL，Rnase Inhibitor(40U/μl)0.5μL，RNase free water 4.5μL。反應(yīng)程序：30℃10min，42℃ 60min，70℃15min[9]。

1.2.3 qPCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為10μL。包括cDNA 1μL，2×MIX 5μL，上下游引物各0.4μL，RNase free water補(bǔ)足至10μL。β-actin作為內(nèi)參，引物序列為：上游5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，下游5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′。定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，擴(kuò)增反應(yīng)95℃10s，60℃10s，72℃15s，共45個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)lncRNA之間差異分析是由REST-2009(版本2.0.13)處理，采用隨機(jī)性檢測(cè)方法。

2 結(jié) 果

14種lncRNA表達(dá)散點(diǎn)圖如圖1所示，圖2為lncRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明ATB、EBIC、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7種lncRNA表達(dá)差異均小于2倍；HEIH、hLACR1、Nbla10727、Nbla12061、UC.388等5種lncRNA在成骨不全骨組織中表達(dá)上調(diào)，上調(diào)幅度在2.68-7.32倍之間，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LSINCTS、PRNCR1等2種lncRNA表達(dá)下調(diào)，其中PRNCR1表達(dá)(P值＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

圖1 成骨不全骨組織14種lncRNA相對(duì)表達(dá)分析散點(diǎn)圖。圖2 成骨不全骨組織14種lncRNA相對(duì)表達(dá)。

lncRNA較編碼蛋白質(zhì)的RNA研究開(kāi)始較晚，隨著lncRNA研究的深入，越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)。lncRNA的研究多在腫瘤中報(bào)道，關(guān)于骨相關(guān)疾病報(bào)道較少。但是有與lncRNA關(guān)聯(lián)基因突變而引起骨相關(guān)疾病的研究，例如，UC.388的相關(guān)基因TCF12[10]，而TCF12基因發(fā)生突變會(huì)引起新生兒顱縫早閉[11]；LOC285194缺失會(huì)引起腫瘤抑制基因(編碼的邊緣系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白)拷貝數(shù)的改變，從而引起骨肉瘤的發(fā)生，并且LOC285194可以通過(guò)調(diào)控凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄等方面促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[12]。

本研究探討了HOTAIR等14種lncRNA在成骨不全患者骨組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PRNCR1低表達(dá)，但仍然需要后續(xù)的進(jìn)一步擴(kuò)大樣本以及血樣樣本的驗(yàn)證。目前關(guān)于PRNCR1的研究多限于腫瘤研究，通過(guò)siRNA降低PRNCR1表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng),同時(shí)反式激活雄激素受體，表明PRNCR1可能通過(guò)調(diào)控雄激素受體活性來(lái)影響前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。在結(jié)腸直腸癌中，PRNCR1下降會(huì)使處于GO/G1細(xì)胞比例減少，處于S期的細(xì)胞明顯增加，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增值[14]。PRNCR1的低表達(dá)在成骨不全中的作用尚有待于進(jìn)一步研究。

另外，該研究中所差異變化沒(méi)有顯著性意義的一些lncRNA有一些在腫瘤組織中有差異表達(dá)。例如，HOTAIR在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，誘導(dǎo)全基因組重新定位起始復(fù)合物2，導(dǎo)致H3K27甲基化和改變基因表達(dá)模式，增加了侵襲性和轉(zhuǎn)移性[15]。

成骨不全作為遺傳性結(jié)締組織疾病，具有表型與基因型異質(zhì)性，致病基因數(shù)量多且致病分子機(jī)制復(fù)雜多樣。但是絕大多數(shù)成骨不全患者是由于I型膠原蛋白結(jié)構(gòu)基因COL1A1和COL1A2基因突變所致[16]。對(duì)成骨不全lncRNA的分析，能為該類疾病的分子標(biāo)記物以及機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

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The Differential Expression of 14 Kinds of Long Non-coding RNAs in Osteogenesis Imperfect*

TENG Yuan-wei, REN Xiu-zhi, WANG Yan-yu, et al., School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong; Academy of Medical Sciences, Jinan 250022,China

ObjectiveTo explore the differential expression of 14 kinds of long non?--coding RNAs in bone tissues derived from osteogenesis imperfecta patients.MethodsRT-qPCR was performed to detect the expression level of 14 Kinds of lncRNAs including ATB, EBIC, HEIH, hLACR1, HOTAIR, PVT1, LET, Loc285194, SRHC, LSINCTS, Nbla10727, Nbla12061, PRNCR1 and UC.388 in bone tissues derive from osteogenesis imperfect (OI) patients who received corrective surgery. Bone tissues from developmental dysplasia of the hip (DDH) were used as control. REST-2009 was performed to analyze theResults.ResultsThe expression of PRNCR1 was signifcantly down-regulated in OI bone tissues. There’s no differential expression was observed in other thirteen lncRNAs, though the expression of HEIH, hLACR1, Nbla10727, Nbla12061 and UC.388 were up-regulated and LSINCTS was down-regulated. The expression of ATB,EBIC, HOTAIR, PVT1, LET, Loc285194 and SRHC was less than 2-fold of DDH control.Conclusions Low expression of PRNCR1 was observed in bone tissue from OI patients. The functions of PRNCR1 in OI need further study.

Osteogenesis Imperfecta; IncRNA; Bone Tissue; PRNCR1

R319

A

中國(guó)罕見(jiàn)疾病防治研究與示范(2013BAI07B00)

2016-04-08

滕元偉，男，藥學(xué)專業(yè)，碩士研究生，主要研究方向：成骨不全相關(guān)lncRNA表達(dá)差異篩選

魯艷芹

D0I:10.3969/j.issn.1009-3257.2016.02.021