李艷華，許建，于騰

（1．山東省濟寧市傳染病醫(yī)院，濟寧 272000；2．山東省濟寧市疾病預(yù)防控制中心，濟寧 272000；3．山東省濟寧市第一人民醫(yī)院，濟寧 272000）

·論著·

雷公藤多苷對變應(yīng)性接觸性皮炎患者干擾素誘導(dǎo)蛋白10及其受體表達的影響

李艷華1，許建2，于騰3

（1．山東省濟寧市傳染病醫(yī)院，濟寧 272000；2．山東省濟寧市疾病預(yù)防控制中心，濟寧 272000；3．山東省濟寧市第一人民醫(yī)院，濟寧 272000）

目的觀察雷公藤多苷對變應(yīng)性接觸性皮炎患者（Allergic contact dermatitis，ACD）體外培養(yǎng)外周血淋巴細胞干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP－10）及其受體CXCR3表達的影響，進一步探討雷公藤多苷治療變應(yīng)性接觸性皮炎的機理。方法 用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）及流式細胞術(shù)，檢測不同濃度雷公藤多苷溶液體外培養(yǎng)48 h后的ACD患者外周血淋巴細胞中IP－10/CXCR3的表達。結(jié)果 雷公藤多苷高、中、低3個濃度組體外培養(yǎng)的ACD患者外周血淋巴細胞中IP－10 mRNA表達明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；3個濃度組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。雷公藤多苷3個濃度組體外培養(yǎng)的ACD患者外周血淋巴細胞表面CXCR3分子的表達低于對照組，只有高濃度組與之比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；高與低濃度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），其余組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論 雷公藤多苷可以抑制體外培養(yǎng)ACD患者外周血淋巴細胞中IP－10 mRNA及其受體CXCR3的表達，從而抑制或減輕炎癥的產(chǎn)生，或許是雷公藤治療ACD機理之一。

雷公藤多苷；變應(yīng)性接觸性皮炎；干擾素誘導(dǎo)蛋白10；趨化因子受體CXCR3

變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）是常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機理復(fù)雜。近年來，趨化因子干擾素誘導(dǎo)蛋白10（Interferoninducible protein 10，IP－10）及其受體（Chemokinereceptor，CXCR3）在ACD發(fā)病中的作用受到重視[1]。雷公藤具有強大的抗炎、免疫抑制作用，臨床使用其治療ACD收到很好的效果，但其機制尚未完全明確。本研究通過觀察雷公藤多苷對體外培養(yǎng)ACD患者外周血淋巴細胞趨化因子IP－10及其受體CXCR3表達的影響，試探討雷公藤治療ACD的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 40例ACD患者來自2015年6月—2016年1月濟寧市第一人民醫(yī)院皮膚科門診，其中男22例，女18例，年齡21～70歲，平均（37．48± 12．41）歲，所有患者均符合《臨床皮膚病學(xué)》[2]中有關(guān)ACD的有關(guān)診斷標準。選擇從業(yè)查體的健康人員16例作為健康對照組，其中男10例，女6例，年齡19～35歲，平均（23．16±2．26）歲。

1.1.2 主要試劑及儀器 雷公藤多苷片（湖南協(xié)力）；PE標記抗人CXCR3熒光抗體（晶美）；超凈工作臺（蘇凈）；流式細胞儀（BD）；電泳儀（北京六一）；熒光定量PCR儀（ABI）；蛋白核酸定量測定儀（Eppendorf）；凝膠成像系統(tǒng)（伯樂）；RT－PCR試劑盒（大連寶生物）。

1.2 方法

1.2.1 雷公藤多苷溶液制備 稱取10 mg雷公藤多苷溶于1 mL二甲基亞砜，加入9 mL的RPMI－1640培養(yǎng)液，然后取配好的上述液體0．5 mL，加入到9．5 mL的RPMI－1640培養(yǎng)液中，其濃度為50 μg/mL，濾菌分裝。培養(yǎng)時雷公藤多苷的高、中、低濃度的終濃度分別為5．0、1．0、0．5 mg/L[3]。

1.2.2 外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng) ACD患者和健康者均空腹取外周靜脈血5 mL，肝素抗凝，加入等量的Hanks液混勻，移液管吸取稀釋血液加于淋巴細胞分離液上，保持淋巴細胞分層液與血樣品之間的界限清晰，2 000 r/min離心20 min后，液體分為4層，吸取第二層白膜狀的單個核細胞層液體，加入5倍量的Hanks液洗滌1次，1 000 r/min離心10 min，離心后將沉淀的細胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培養(yǎng)液配成單細胞懸液。取單細胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，每孔0．5 mL，根據(jù)MTT試驗結(jié)果，分別加入含有不同濃度雷公藤多苷的RPMI－1640培養(yǎng)液，以加有單細胞懸液而不含有雷公藤多苷的培養(yǎng)液孔為空白對照組，以健康人群作為健康對照組，混勻后放入含有5%CO2的CO2溫箱內(nèi)，37℃，培養(yǎng)48 h后進行實驗檢測。

1.2.3 RT－PCR法檢測IP－10 mRNA 采用細胞總RNA Trizol試劑提取RNA，嚴格按照試劑說明書進行，取少量在紫外分光光度計260 nm和280 nm下確定濃度和純度，并在1．2%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后進行凝膠成像分析。引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計合成，GAPDH為內(nèi)參基因：IP－10：5’－GGCCATCAAGAATTTACTGAAAGCA －3’，5’ －TCTGTGGGTCCATCCTTGGAA－3’；GAPDH：5’－GC ACCGTCAAGGCTAGAAC－3’，5’－TGGTGAAGACG CCAGTGGA－3’。按照RT－PCR試劑盒方法對外周血淋巴細胞中IP－10 mRNA的相對表達量進行測定。反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，再根據(jù)一定的閾值取其CT值，2－△△CT法測定IP－10 mRNA的相對表達量。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測CXCR3 吸取培養(yǎng)孔內(nèi)細胞，移入10 mL離心管中，1 500 r/min，離心5 min，吸棄上清；用1 mL PBS重懸細胞，分入2個流式試管中；分別離心，棄上清液，洗滌細胞1次，吸棄上清；每管分別加入10 μL PE CXCR3抗體；震蕩，室溫避光保存30 min；加入500 μL 4%多聚甲醛，流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11．5統(tǒng)計軟件處理，以均數(shù)±標準差（s）表示，計量資料比較采用方差分析進行統(tǒng)計，組間兩兩比較運用SNK檢驗。P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IP－10 mRNA的表達 從IP－10的PCR產(chǎn)物的電泳圖可看到，IP－10的產(chǎn)物大小為110 bP，GAPDH的產(chǎn)物大小為138 bP，IP－10和GAPDH的產(chǎn)物均符合設(shè)計的片段長度，見圖1。雷公藤多苷高、中、低3個濃度組體外培養(yǎng)的ACD患者外周血淋巴細胞中IP－10mRNA表達均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01或P＜0．05）；雷公藤多苷3個濃度組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表1。

圖1 IP-10及GAPDH的PCR產(chǎn)物的電泳圖

2.2 CXCR3的表達 雷公藤多苷高、中、低3個濃度組體外培養(yǎng)的ACD患者外周血淋巴細胞表面CXCR3分子的表達均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；雷公藤多苷3個濃度組間比較，高濃度組與低濃度組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。

表1 雷公藤多苷對ACD患者外周血淋巴細胞IP-10 mRNA表達的影響(△CT)

表2 雷公藤多苷對ACD患者外周血淋巴細胞CXCR3表達的影響

3 討論

干擾素誘導(dǎo)蛋白（IP－10）是由IFN－γ/或脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類屬于CXC類亞家族的趨化因子，主要來源于單核巨噬細胞和T淋巴細胞，其可與表達在T細胞表面的受體趨化因子CXCR3結(jié)合促進其活化，招募T淋巴細胞、單核巨噬細胞等免疫細胞向病變部位聚集，促進炎癥反應(yīng)[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5－6]，在毛細支氣管炎患兒外周血淋巴細胞及結(jié)核性胸膜炎患者外周血血清中IP－10/CXCR3的表達均增加，提示IP－10/CXCR3參與了疾病的免疫應(yīng)答過程和炎性反應(yīng)。ACD是一種由CD4＋Th1細胞介導(dǎo)的Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，IP－10在ACD中表達，其受體CXCR3在ACD中也呈優(yōu)勢表達[7]。有研究推測[8]，ACD中CXCR3與IP－10結(jié)合，誘導(dǎo)更多的Th1細胞聚集，介導(dǎo)免疫反應(yīng)。

雷公藤多苷是雷公藤根的水－氯仿提取物，具有強大的抗炎和免疫抑制作用，單用或聯(lián)合應(yīng)用于多種免疫性及變應(yīng)性皮膚病的治療，取得了良好療效[9]。徐曉光等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷公藤多苷片治療后的自身免疫性甲狀腺炎大鼠，外周血細胞中的CXCR3 mRNA表達減少，推測可能是通過調(diào)整CXCR3的水平而抑制炎癥的發(fā)生。雷公藤多甙治療后的銀屑病患者外周血CD4＋細胞降低至正常水平，推測雷公藤多苷可能通過抑制外周血中CD4＋細胞的活化，使進入皮損內(nèi)的CD4＋細胞數(shù)減少，從而抑制CD4＋細胞釋放細胞因子，表明雷公藤多甙可有效抑制銀屑病患者外周血T淋巴細胞亞群活性[11]，而ACD正是一種由CD4＋Th1細胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)。羅育武等曾經(jīng)使用雷公藤多苷片治療ACD，療效較好[12]。

本研究顯示，雷公藤多苷可以明顯抑制ACD患者外周血淋巴細胞中IP－10 mRNA表達，與邢艷玲等[13]的研究結(jié)果相似，但本研究所設(shè)雷公藤多苷濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。雷公藤多苷也可以抑制體外培養(yǎng)的ACD患者外周血淋巴細胞表面CXCR3的表達，且高低濃度間抑制效果有差異。筆者推測，由于雷公藤多苷抑制了ACD患者淋巴細胞中趨化因子IP－10及其受體CXCR3的表達，誘導(dǎo)了T細胞的凋亡，減少了T細胞的數(shù)量，從而使炎細胞不能移行、募集到局部皮膚，從而抑制或減輕炎癥的產(chǎn)生，或許是雷公藤治療ACD機制之一。

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Effects of Glycosides on the Expression of Interferon Inducible Protein 10 and Its Receptor in Allergic Contact Dermatitis Patients

Li Yanhua1,Xu Jian2,Yu Teng3
1.Infectious Disease Hospital of Jining,Jining 272000,China;2.Jining Center for Disease Control and Prevention,Jining 272000,China;3.Jining NO.1 People's Hospital,Jining 272000,China.

ObjectiveIn order to observe the effect of Tripterygium Glycosides on interferon－inducible protein 10(IP－10) and its receptor(CXCR3)in allergic contact dermatitis(ACD)patients，thus further discusses the mechanism of this medicine in the treatment of contact dermatitis．MethodsThe expression of IP－10/CXCR3 in peripheral lymphocytes from ACD patients incubated in vitro with Tripterygium Glycosides was detected by reverse transcription PCR （RT－PCR）and flow cytometry．ResultsCompared with the control group，three different concentration groups of Tripterygium Glycosides remarkably suppressed the expression of IP－10 mRNA in vitro culture Splenic lymphocyte of ACD patients（P＜0．01）；while there was no significant difference among the three different concentration groups of Tripterygium Glycosides（P＞0．05）．Three different concentration groups of Tripterygium Glycosides all suppressed the expression of CXCR3 in vitro culture Splenic lymphocyte of ACD patients．There were significant differences between the high concentration group and the control group，the high concentration group and the low concentration group．ConclusionTripterygium Glycosides can obviously suppress the expression of IP－10/CXCR3 in vitro culture lymphocyte of ACD patients，which maybe one of the mechanisms of Tripterygium Glycosides'treatment on ACD．

Ripterygium glycosides;Allergic contact dermatitis；Interferon－inducible protein 10;Chemokine receptor CXCR3

R758.22

A

1672－0709（2016）05－0273－03

2016－02－01）

許建，E-mail:xujian20040703@126.com