路新彥，劉 昆，蔣 俊，鄭巧平，宋小亞（麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

7個(gè)黑木耳菌株遺傳差異性分析*

路新彥，劉 昆，蔣 俊，鄭巧平**，宋小亞
（麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

采用拮抗試驗(yàn)、酯酶同工酶和分子標(biāo)記對(duì)引進(jìn)7個(gè)黑龍江主栽黑木耳菌株進(jìn)行遺傳差異分析。結(jié)果表明，在黑木耳遺傳差異性分析中，3種方法具有一致性。通過(guò)酯酶同工酶與分子標(biāo)記聚類(lèi)分析，均能將來(lái)自于黑龍江同一地域的黑木耳分為4個(gè)類(lèi)別：黑威9號(hào)與981遺傳距離最近為第一類(lèi)，黑威10號(hào)、8808與第一類(lèi)2個(gè)菌株遺傳距離較近為第二類(lèi)，黑29與第一類(lèi)、第二類(lèi)4個(gè)菌株遺傳距離較遠(yuǎn)為第三類(lèi)，而9809、H916與以上5個(gè)菌株遺傳距離最遠(yuǎn)為第四類(lèi)。同時(shí)在拮抗試驗(yàn)中黑29、9809、H916三個(gè)遺傳距離較遠(yuǎn)的菌株也表現(xiàn)出明顯的拮抗現(xiàn)象。研究結(jié)果為黑木耳新品種引選以及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)分析提供技術(shù)支撐。

黑木耳；拮抗；酯酶同工酶；分子標(biāo)記

黑木耳（Auricularia auricula） 是我國(guó)廣泛人工栽培的食用菌種類(lèi)之一，種質(zhì)資源豐富。目前栽培菌株主要通過(guò)野生菌株馴化而來(lái)，生產(chǎn)用種來(lái)源很多，各地相互引種頻繁，菌株命名混亂。采用傳統(tǒng)的生物學(xué)形態(tài)進(jìn)行鑒別，周期長(zhǎng)，易受環(huán)境因素和生理狀況的影響，尤其對(duì)形態(tài)差異較小的菌株很難鑒別。如何簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地將黑木耳菌株區(qū)分開(kāi)來(lái)，已成為廣大科研工作者研究的主要內(nèi)容。分別用酯酶同工酶和分子標(biāo)記方法進(jìn)行黑木耳菌株遺傳差異性分析的文章已有報(bào)道[1-3]，但同時(shí)采用3種方法比較分析的文章尚未報(bào)道。本文通過(guò)拮抗、酯酶同工酶和分子標(biāo)記對(duì)7個(gè)黑龍江黑木耳菌株進(jìn)行遺傳差異性分析，旨在為黑木耳品種引選和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的黑木耳7個(gè)菌株分別為黑威9號(hào)、黑威10號(hào)、黑29、8808、981、9809和H916，均由黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所提供。

1.2 試劑與儀器

1．2．1 培養(yǎng)基

固體PDA培養(yǎng)基和液體PDA培養(yǎng)基。

1．2．2 試劑與儀器

本試驗(yàn)所用的RAPD、ISSR引物由上海生工生物工程公司合成。移液器、離心機(jī) （Eppendorf5424）、PCR儀（Eppendorf，Mastercycler）、電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-8C型）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，Gel Doc XR＋）。

1.3 拮抗試驗(yàn)

將供試菌株兩兩接種于PDA平板培養(yǎng)基上，26℃下培養(yǎng)25 d，觀察不同菌株間是否有拮抗線的存在和拮抗線是否明顯。

1.4 DNA提取

1．4．1 菌絲培養(yǎng)收集

用接種耙將PDA斜面菌種耙碎，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株各2瓶，于25℃下，搖床120 r·min-1培養(yǎng)至菌絲球生長(zhǎng)較密，收集菌絲0．5 g，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4．2 DNA提取

采用CTAB法提取DNA。

1.5 差異性檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序參照農(nóng)業(yè)部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，分別為NYT 1743-2009食用菌菌種真實(shí)性鑒定RAPD法和NYT 1730-2009食用菌菌種真實(shí)性鑒定ISSR法。

1.6 酯酶同工酶電泳

制膠、電泳、染色方法參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1097-2006食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法。

1.7 聚類(lèi)分析

用NTYSYpc2．1軟件計(jì)算相似系數(shù)，得相似性系數(shù)矩陣，用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，生成聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 菌絲拮抗試驗(yàn)結(jié)果

拮抗試驗(yàn)得到21個(gè)組合，存在拮抗現(xiàn)象：黑29、9809、H916三個(gè)菌株拮抗明顯，9809和8808、 981兩兩拮抗明顯，說(shuō)明它們彼此不親和。拮抗試驗(yàn)情況見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌株間拮抗現(xiàn)象Fig．1 Antibiosis among different strains

拮抗現(xiàn)象不明顯的有：黑威9號(hào)與黑29、8808、981、9809、H916；黑威10號(hào)與9808；H916與黑威10號(hào)、8808、981。說(shuō)明它們有一定的親和力，但不能確定它們的遺傳關(guān)系。無(wú)拮抗現(xiàn)象的有：黑威10號(hào)與黑威9號(hào)、黑29、8808、981；981與黑29、8808。說(shuō)明它們彼此親和力強(qiáng)，遺傳較相近，具體見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)981、黑威10號(hào)與黑29三者兩兩沒(méi)有拮抗現(xiàn)象，親和性強(qiáng)，表明他們的遺傳距離接近。

表1 7個(gè)黑木耳菌株拮抗試驗(yàn)結(jié)果Tab．1 Anatagonistic effect of 7 Auricularia auricula strains

2.2 酯酶同工酶試驗(yàn)結(jié)果

2．2．1 酯酶同工酶酶譜及其遷移率

酯酶同工酶對(duì)7個(gè)不同黑木耳菌株的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 酯酶同工酶對(duì)7個(gè)黑木耳菌株的擴(kuò)增圖譜Fig．2 Esterase isozyme patterns of 7 Auricularia auricula strains

由圖2可知，在整個(gè)酶帶分布區(qū)間內(nèi)各菌株產(chǎn)生酶帶的數(shù)量和酶帶強(qiáng)弱有一定的差異，這表明各菌株之間還是存在一定的遺傳距離。7個(gè)黑木耳菌株分別出現(xiàn)8條～11條酶帶，遷移率（Rf）在0．286～0．792。當(dāng)Rf在623與0．688處，酶譜上均有活性很強(qiáng)的酶帶，可能為黑木耳的基礎(chǔ)酶譜帶。當(dāng)Rf在0．455、0．539、0．623、0．688處，7個(gè)菌株分別有出現(xiàn)酶帶，且為多態(tài)性特征帶。當(dāng)Rf在0．773和0．792處，9809和H916兩個(gè)菌株沒(méi)有出現(xiàn)酶帶，而其他5個(gè)菌株都有明顯酶帶。

2．2．2 菌株間相似系數(shù)

按Nei或Li（1997）公式計(jì)算菌株間的相似系數(shù)Sc[4]，見(jiàn)表2。

表2 7個(gè)黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜的相似系數(shù)Tab．2 Ester ase isoenzyme similarity coefficient of 7 Auricularia auricula strains

由表2可知，7個(gè)黑木耳菌株之間的相似系數(shù)（Sc）在0．588～1，相似系數(shù)都較大，說(shuō)明菌株親緣關(guān)系都很近[5]，也許因?yàn)樗鼈儊?lái)自于相同的地理區(qū)域。其中黑威9、黑威10號(hào)與981菌株的相似系數(shù)Sc為1，說(shuō)明這三個(gè)菌株親緣關(guān)系非常近，有相同或者相近的遺傳基礎(chǔ)。

2．2．3 7個(gè)黑木耳菌株的酯酶同工酶條帶聚類(lèi)分析

通過(guò)NTYSYpc2．1軟件分析得到黑龍江7個(gè)黑木耳菌株的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖3。

圖3 7個(gè)黑木耳的酯酶同工酶聚類(lèi)分析圖Fig．3 Dendrogram based on esterase isozyme cluster analysis of 7 Auricularia auricula strains

由圖3可知，當(dāng)相似系數(shù)Sc為0．889時(shí)，可將7個(gè)黑木耳菌株分為4個(gè)類(lèi)別：H916為第一類(lèi)，9809為第二類(lèi)，黑29為第三類(lèi)，8808和981、黑威9號(hào)及黑威10號(hào)為第四類(lèi)。

2.3 分子標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)果

2．3．1 引物篩選和PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)使用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中所提供的22個(gè)RAPD引物和28個(gè)ISSR引物，對(duì)7個(gè)供試黑木耳菌株進(jìn)行分析，篩選得到8個(gè)RAPD引物和10個(gè)ISSR引物，擴(kuò)增獲得分辨率高、反應(yīng)穩(wěn)定性較好和多態(tài)性豐富的條帶，具體見(jiàn)表3。

表3 試驗(yàn)引物信息Tab．3 Information of primers

試驗(yàn)共擴(kuò)增出條帶185條，大小分布在500 bp～2 000 bp，其中多態(tài)性條帶132條，多態(tài)性比率為71．35%，部分圖譜結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 RAPD引物S12、S13對(duì)7個(gè)黑木耳菌株的擴(kuò)增圖Fig．4 RAPD amplification patterns of primers S12 and S13

2．3．2 聚類(lèi)分析

使用NTSYSpc-2．1軟件計(jì)算菌株間的Nei遺傳距離為0．61～0．89，應(yīng)用UPGMA方法進(jìn)行的遺傳距離聚類(lèi)分析,得到7個(gè)菌株親緣關(guān)系樹(shù)狀圖見(jiàn)圖6。

圖5 ISSR引物P28、P29對(duì)7個(gè)黑木耳菌株的擴(kuò)增圖Fig．5 ISSR amplification patterns of primers P28 and P29

圖6 7個(gè)黑木耳的UPGMA聚類(lèi)圖Fig．6 UPGMA tree of 7 Auricularia auricula strains

從圖6中可以看出，相似系數(shù)在0．825水平將7個(gè)菌株分為4個(gè)類(lèi)群：981與黑威9號(hào)為第一類(lèi)；黑威10號(hào)與8808為第二類(lèi)；H916為第三類(lèi)；9809為第四類(lèi)。

3 討論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)在黑木耳遺傳差異性分析中，3種方法具有一致性。酯酶同工酶與分子標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果比較，均能發(fā)現(xiàn)黑威9號(hào)與981遺傳距離最近，這兩個(gè)菌株與黑威10號(hào)、8808遺傳距離較近，黑29與以上4個(gè)菌株較遠(yuǎn)，而9809、H916與以上5個(gè)菌株遺傳距離最遠(yuǎn)。同時(shí)在拮抗試驗(yàn)中黑29、9809、H916三個(gè)菌株拮抗明顯，9809和8808、981兩兩拮抗明顯，它們彼此不親和，在此對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行了更充分的驗(yàn)證。

但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于酯酶活性易受到外界因素的影響，酯酶同工酶的穩(wěn)定性以及試驗(yàn)的可重復(fù)性不高。分子標(biāo)記是直接從DNA水平上來(lái)檢測(cè)基因組的多態(tài)性[6]，不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響，重復(fù)性好，適合用于黑木耳生產(chǎn)菌株快速準(zhǔn)確鑒定。菌絲拮抗有著其直觀性的優(yōu)點(diǎn)，但需要進(jìn)一步的生物化學(xué)方法的輔助和補(bǔ)充，對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有促進(jìn)作用。

本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方法，快速、準(zhǔn)確地分析比較7個(gè)黑木耳菌株遺傳差異性，但在新品種引選和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中還需要進(jìn)一步考察其栽培性狀和產(chǎn)量等特性，以指導(dǎo)實(shí)際應(yīng)用。進(jìn)一步探明不同基因條帶與對(duì)應(yīng)特定性狀的關(guān)系，比如菌絲活力強(qiáng)弱、耳片顏色深淺、耳脈多少等栽培特性，將是未來(lái)菌株遺傳差異性分析的發(fā)展方向。

[1]郭興，李滇華，任廣明，等．ISSR分子標(biāo)記鑒別黑龍江地區(qū)黑木耳主栽菌株的研究[J]．中國(guó)林副特產(chǎn)，2010（6）：14-16．

[2]唐利華，郭倩，王瑞娟，等．中國(guó)黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2007，14（4）：37-40．

[3]張介馳，馬慶芳，張丕奇，等．用RAPD分子標(biāo)記鑒別黑木耳菌種的研究[J]．菌物研究，2006，4（4）：54-56．

[4]高娃，張丕奇，黨阿麗，等．東北黑木耳野生菌株比較[J]．食藥用菌，2013，21（4）：230-232．

[5]何彥，曾曉麗，汪思迪，等．黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜多樣性研究[J]．生物技術(shù)，2009，19（6）：8-10．

[6]劉春勇，張文成，任改新．蘇蕓金芽胞桿菌與蠟狀芽胞桿菌基因組DNA同源性及多態(tài)性的研究[J]．南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1999，32（2）：98-102，102．

Study on Genetic Polymorphism of 7 Auricularia auricula Strains

LU Xin-yan,LIU Kun,JIANG Jun,ZHENG Qiao-ping,SONG Xiao-ya
（Lishui Academy of Agricultural Sciences,Lishui 323000,China）

Genetic diversity of seven strains of Auricularia auricular from Heilongjiang province were analyzed by antagonistic reaction,esterase isoenzyme and DNA marker respectively．Both of the data from RAPDISSR and antagonistic effect indicated that seven strains could be devided into four distinct groups,such as the first group included Heiwei 9 and 981,the second group included Heiwei 10 and 8808,the third group included single strain Hei29,the 9809 and H916 were classified to the last group．Meanwhile,the antagonistic reaction showed that the three isolates with longer genetic distance of Hei 29,9809 and H916 also showed obvious antagonistic effect．The present study indicated that results obtained by the three methods were consistent,which could provide technical support for new species selection and germplasm resources evaluation of A.auricula．

Auricularia auricula;antagonistic effect;ester ase isoenzyme;molecular marker

S646.6

A

1003-8310（2017）01-0052-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．012

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-24）；浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2016c02057-2）。

路新彥（1980-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌栽培育種及菌種檢測(cè)研究。E-mail:luxy1108＠163．com

**通信作者：鄭巧平（1968-），男，本科，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事食（藥）用菌栽培育種及廢菌糠資源化利用。E-mail:lsnks＠163．com

2016-11-20