李建平，曾文波（文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

蟲草核苷類成分的提取方法

李建平，曾文波*
（文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

該研究篩選出1種提取蟲草核苷類成分的方法。采用高效液相色譜法，流動(dòng)相為10%甲醇溶液，流速為1 mL·min-1，檢測波長260 nm，進(jìn)樣量10 μL，測定不同提取溶劑和提取條件制備供試液中尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素含量。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為20%甲醇溶液，提取方法為超聲處理，提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)為3次，蟲草樣品中核苷類成分可被充分提取。該方法適用于蟲草水溶性核苷類成分供試液的制備，為準(zhǔn)確測定蟲草類真菌樣品水溶性核苷類成分提供了依據(jù)。

蟲草類真菌；核苷類成分；HPLC；提取

蟲草類真菌（Cordyceps-like fungi）是一類寄生于昆蟲、蜘蛛等節(jié)肢動(dòng)物和一些真菌上的真菌類群[1，2]。按照真菌詞典第10版、Sung等和Kepler等關(guān)于蟲草類真菌的分類系統(tǒng)[1-3]，分別屬于真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomyceles）肉 座 菌 亞綱 （Hypocreomycetidae） 肉 座 菌 目（Hypocreales） 中的3個(gè)科5個(gè)屬，包括艷蟲草科（Cordycipitaceae） 蟲草屬（Cordyceps），線蟲草科（Ophiocordycipitaceae） 大團(tuán)囊蟲草屬（Elaphocordyceps）、線蟲草屬 （Ophiocordyceps）、多頭霉屬（Polycephalomyces）和麥角菌科（Clavicipitaceae）泛蟲草屬（Metacordyceps）。目前，市場上最常見的蟲草主要有蟬花蟲草（Isaria cicadae Miq．）、冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis（Berk．）G．H．Sung,J．M．Sung, Hywel-Jones&Spatafora]和蛹蟲草 [Cordyceps militaris（Fr．）Link．]等。蟲草具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腎功能、恢復(fù)肝功能、抗氧化和調(diào)節(jié)心血管功能等多種藥理藥效[4-7]，主要含糖醇類、氨基酸類、核苷類、甾醇類、生物堿類和無機(jī)元素等化學(xué)成分[7]。其中，水溶性核苷類成分是蟲草類真菌中主要活性成分之一[8]。HPLC是測定水溶性核苷類成分的主要方法之一[9-14]。該方法樣品前處理溶劑主要有水、甲醇和甲醇溶液，提取方法有超聲法和熱水浴法，提取時(shí)間為15 min至120 min[9，11，12，15-20]。同一種蟲草中核苷類成分含量差異較大，這除了與蟲草不同的地理來源和蟲草成熟度相關(guān)以外，還與蟲草樣品前處理方法有關(guān)[12]。

本研究以蟬花蟲草、冬蟲夏草和蛹蟲草等為試驗(yàn)材料，采用HPLC測定蟲草樣品中尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素的含量，旨在找到1種簡便適用的方法用于提取蟲草樣品中核苷類成分，為準(zhǔn)確測定蟲草類真菌核苷類成分含量提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟬花蟲草采至四川鄉(xiāng)城縣，冬蟲夏草采自青海省玉樹縣，蛹蟲草由云百草實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)（菌株分離的野生蛹蟲草，采自云南省昆明市嵩明縣白邑鄉(xiāng)），將上述蟲草材料烘干，粉碎，過80目篩，充分混勻，備用。

尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等對照品購自Sigma公司，純度為98%以上；甲醇（色譜純，Merck KGaA Darmstadt,Germany）；甲醇（分析純，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司）；去離子水（Millipore純化系統(tǒng)，Billerica，MA，USA）。

1.2 儀器與設(shè)備

戴安ULTIMATE 3000高效液相色譜儀（LPG-3400A四元梯度泵，WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器，PDA-3000二極管陣列檢測器，TCC-3000柱溫箱，Waters Symmetry C18色譜柱，5 μm，4．6 mm×250 mm，“變色龍”控制分析色譜工作站軟件）；SK5200超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；50 g手提式高速萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；電熱水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1．3．1 色譜條件

流動(dòng)相為甲醇-水（10∶90）；等度洗脫，流速1．0 mL·min-1；檢測波長260 nm；柱溫30℃。在該色譜條件下，尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等對照品色譜峰均能較好地分離，見圖1。

1．3．2 對照品溶液的配制

分別稱取干燥至恒重的尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等對照品各2 mg，20%甲醇溶解并定容至100 mL。

1．3．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取對照品溶液0．2 μL、0．5 μL、1．0 μL、2．0 μL、4．0 μL、6．0 μL、8．0 μL、10．0 μL、15．0 μL、20．0 μL、50．0 μL、80．0 μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量（換算成對照品重量） 為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）求回歸方程，詳見表1。對照品和樣品HPLC圖見圖1。

表1 核苷類成分的回歸方程、線性系數(shù)與檢測范圍Tab．1 Regression equation,correlation coefficient and test range of nucleoside components

1．3．4 樣品處理方法和提取溶劑

精密稱取0．1000 g的蟲草樣品于5 mL離心管中，分別加入提取溶劑純水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、80%甲醇、100%甲醇各3 mL，蓋緊，混勻，稱重，分別超聲和80℃熱水浴處理2 h，放至室溫，稱定重量。補(bǔ)充相應(yīng)溶劑至處理前重量，離心，0．45 μm微孔濾膜濾過，即為供試液，然后按照上述色譜條件測定供試液中10種核苷類成分含量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1．3．5 超聲提取時(shí)間

精密稱取0．1000 g蟲草樣品于5 mL離心管中，分別加入20%甲醇溶液3 mL，蓋緊，混勻，稱重，按提取時(shí)間15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min分別超聲處理后，放至室溫，稱定重量。補(bǔ)充20%甲醇溶液至處理前重量，離心，0．45 μm微孔濾膜濾過，即為供試液，然后按照上述色譜條件測定供試液中核苷類成分含量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

圖1 3種蟲草核苷類成分HPLC圖Fig．1 HPLC chromatograms of nucleosides in Cordyceps s．l．

1．3．6 超聲提取次數(shù)

精密稱取0．1000 g蟲草樣品于5 mL離心管中，加入20%甲醇溶液3 mL，蓋緊，混勻，稱重，超聲處理90 min，放至室溫，稱定重量。補(bǔ)充20%甲醇溶液至處理前重量，離心，0．45 μm微孔濾膜濾過，編為1號供試液。按此方法，將剩余樣品殘?jiān)俜謩e處理3次后得到2號、3號和4號供試液。然后按照上述色譜條件測定供試液中核苷類成分含量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方法和提取溶劑的確定

提取溶劑和樣品處理方法見表2。

HPLC測定數(shù)據(jù)表明，不同的提取溶劑濃度，超聲法對核苷類成分的提取總量均高于熱水浴法，故選取超聲法作為蟲草樣品供試液處理方法。隨著甲醇濃度的提高，無論是采用超聲法，還是熱水浴法，核苷類成分提取總量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，純水、10%甲醇溶液，在使用0．45 μm微孔濾膜過濾時(shí)，難以通過微孔濾膜，這可能是因?yàn)槠渲泻休^多的蛋白質(zhì)和多糖。甲醇濃度為20%時(shí)（超聲法），蟬花蟲草的核苷類成分的提取總量為2 029．37 μg·g-1，冬蟲夏草核苷類成分的提取總量為1 972．28 μg·g-1，蛹蟲草的核苷類成分的提取總量為

4 369．28滋g·g-1。雖然核苷類提取量低于純水的提取量，但考慮到試驗(yàn)的易操作性，將蟲草樣品提取溶劑確定為20%甲醇溶液。

表2 提取溶劑和方法的確定（n=3）Tab．2 Confirmation of extraction solvents and methods（n=3）

2.2 提取時(shí)間和次數(shù)的確定

提取時(shí)間和次數(shù)，以及超聲提取次數(shù)的確定分別見表3、表4。

表3 超聲處理時(shí)間（n=3）Tab．3 Confirmation of ultrasonic treatment time（n=3）

從表3可以看出，超聲提取90 min后，提取液中核苷類成分含量不再有明顯增加，將超聲時(shí)間確定為90 min。由表4可知，蟲草樣品中大部分核苷類成分經(jīng)第1次和第2次超聲即可提取出來，第3次超聲提取液中還可檢測到少量核苷類成分，第4次超聲提取幾乎檢測不到核苷類成分。超聲提取3次可將樣品中98%以上的核苷類成分提取出來，將提取次數(shù)確定為3次。

2.3 樣品中核苷類成分含量

根據(jù)上述核苷類成分測定數(shù)據(jù)，確定蟲草樣品供試液制備方法：稱取蟲草樣品0．1000 g左右，提取溶劑為20%甲醇，每次使用提取溶劑3 mL，提取方法為超聲法，提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)為3次；將3次提取液合并至10 mL容量瓶，定容混勻，0．45滋m微孔濾膜濾過得到供試液。按上述色譜條件測定蟬花蟲草、冬蟲夏草和蛹蟲草樣品中核苷類成分的含量，見表5。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照樣品溶液10滋L，按上述色譜條件連續(xù)測定5次，獲得各成分峰面積，分別計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。其RSD在0．08%～0．58%。

表4 超聲提取次數(shù)（n=3）Tab．4 Confirmation of ultrasonic extraction times（n=3）

表5 3種蟲草樣品中核苷類成分含量Tab．5 Content of nucleosides in Cordyceps s．l．samples

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件分別于不同時(shí)間測定各成分峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其RSD在0．16%～3．33%，對照品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

由于蟬花蟲草和冬蟲夏草中未能檢測到蟲草素，本部分采用蛹蟲草作為供試樣品，分別稱取該樣品0．1000 g共5份，按照“2．3樣品核苷類成分含量測定”的方法處理得到供試液，分別吸取樣品供試液各10 μL，按上述色譜條件測定核苷類成分的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將峰面積換算成對照品重量，并計(jì)算出樣品中各成分含量，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其RSD在0．78%～3．10%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取核苷類成分含量已知的蟬花蟲草樣品0．5000 g共3份，分別置于5 mL離心管中，精密稱量。按照“2．4樣品核苷類成分含量測定”的方法，使用對照品儲(chǔ)備液作為提取溶劑，處理得到供試液，按上述色譜條件測定供試液中核苷類成分含量，計(jì)算尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素的平均回收率（n=3），回收率平均值在97．37%～102．75%，RSD在1．32%～2．55%。

3 討論

無論是采用超聲法還是熱水浴法，隨著提取溶劑中甲醇含量的逐漸升高，蟲草核苷類成分提取總量由高逐漸降低，表明純水是水溶性核苷類成分最好的提取溶劑。但是，蟲草中含有較多的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)[21-23]，如果使用純水作為提取溶劑，蟲草樣品供試液中會(huì)含有較多的多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，且容易滋生微生物，導(dǎo)致液相色譜儀管路和色譜柱的堵塞。另外，樣品供試液變質(zhì)后會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。高濃度甲醇溶液作為提取溶劑，不僅樣品中核苷類成分提取不完全，其核苷類成分峰形不好，且多有雜峰，因而，采用低濃度的甲醇溶液作為核苷類成分提取溶劑效果較好。

提取溶劑和提取方法的不同，可導(dǎo)致HPLC測定樣品中核苷類成分含量出現(xiàn)較大差異[15]，本研究通過分析核苷類成分提取量與提取溶劑、提取方法、提取次數(shù)的關(guān)系，找到1種簡單實(shí)用的方法，可保證蟲草中核苷類成分提取充分，使得蟲草核苷類成分的測定不受提取條件的干擾，為準(zhǔn)確測定蟲草類真菌樣品核苷類成分提供科學(xué)依據(jù)。

本研究用于測定冬蟲夏草、蛹蟲草和蟬花蟲草等蟲草的水溶性核苷類成分的方法，簡單、方便、高效、靈敏和重現(xiàn)性好，在給定的色譜條件下，尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等核苷類成分分離度良好，能定量檢測這10種核苷類成分，為今后蟲草類真菌水溶性核苷類功效成分質(zhì)量評價(jià)提供了方法和依據(jù)。

中國傳統(tǒng)食用冬蟲夏草、蛹蟲草和蟬花蟲草等蟲草類真菌，主要是燉湯后食用[7]。本研究表明，水能有效地提取蟲草中水溶性核苷類成分[21,24]；同時(shí)，水也是提取蟲草多糖、蟲草酸的溶劑[25]，這說明我國傳統(tǒng)食用冬蟲夏草及其它蟲草類真菌的方法是科學(xué)和實(shí)用的。

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An Extraction Method of Nucleosides in Cordyceps s.l.

LI Jian-ping,ZENG Wen-bo
（College of Environment and Resources,Wenshan University,Wenshan 663099,China）

In this study,a suitable method for extracting the nucleosides in Cordyceps s．l．was screened by HPLC,the mobile phase was 10%methanol aqueous solution,the flow rate was 1．0 mL min-1,the detection wavelength was 260 nm,and the injection volume was 10 μL．The contents of uracil,uridine,2’-deoxyuridine,inosine,guanosine,thymidine,adenine,adenosine,2’-deoxyadenosine and cordycepin were determined in the sample solutions,preparing different extraction solvents and extraction conditions．The results showed that the nucleosides were completely extracted,when the extraction solvent was 20%methanol aqueous solution,extraction method was ultrasonic treatment,extraction time was 90 min,and extraction times were 3 times．The extraction condition was suitable for preparing the sample for HPLC determination of nucleosides components,providing a method to determine the nucleosides in Cordyceps-like fungi accurately．

Cordyceps-like fungi;nucleosides;HPLC;extraction

S646.9

A

1003-8310（2017）01-0041-08

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．010

李建平（1989-），女，碩士，助教，主要從事蟲草生物資源開發(fā)與利用。E-mail:lijianping0426＠126．com

*通信作者：曾文波（1982-），男，博士，講師，主要從事蟲草生物資源研究。E-mail:zengwenboherb＠163．com

2016-11-11