周金玲，吳丹丹，周玉龍，朱戰(zhàn)波，樸范澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

氣腫疽梭菌HLJ-1株分離鑒定及系統(tǒng)進化分析

周金玲，吳丹丹，周玉龍，朱戰(zhàn)波，樸范澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

2015年6月，內(nèi)蒙古某牛場爆發(fā)疑似氣腫疽疫病，為了有效防控該病，無菌采集炎性氣腫的肌肉進行需氧和厭氧菌的分離鑒定和藥敏試驗，結(jié)果在厭氧條件下從患病牛肌肉內(nèi)分離出無莢膜，革蘭氏染色呈陽性兩端鈍圓的桿菌。經(jīng)表型特征和生化鑒定表明分離菌株與氣腫疽梭菌相符，進一步對16S rDNA通用引物擴增得到的基因測序結(jié)果分析表明，其與氣腫疽梭菌株同源性最高達95.8%，毒素檢測表明含有α毒素。以上結(jié)果證明該菌株為氣腫疽梭菌。分離菌株對蒽諾沙星、環(huán)丙沙星等藥物高度敏感。為該病的防制提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

牛；氣腫疽梭菌；分離；鑒定

氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）又名費氏梭菌，俗稱黑腿病桿菌，是氣腫疽（Gangraena emhhysematosa）的病源。此病主要是反芻動物的一種急性敗血性傳染病，以皮下組織和肌肉豐滿部位發(fā)生氣性腫脹為特征。病變肌肉常呈暗紅棕色到黑色[1]。本病具有一定的區(qū)域性，但沒有明顯的季節(jié)性。一般放牧牛以夏季多發(fā)，舍飼牛則一年四季均可發(fā)生[2]。其呈散發(fā)或地方性流行，牛發(fā)病一般多呈急性經(jīng)過，食欲和反芻減少或停止，體溫升高，精神不振，輕度跛行，觸診腫脹部位有捻發(fā)音[3]。

2015年6月，內(nèi)蒙古某牛場2周內(nèi)死亡了4頭牛。該牛場位于大山中，周圍人煙稀少，主要飼養(yǎng)斷奶后的犢牛。冬季舍飼，5月中下旬至10月中旬在草原上放牧。2013年春季曾發(fā)生過氣腫疽，當時死亡8頭小牛，確診后注射氣腫疽疫苗，每年春季注射一次。該牛場有兩個放牧場，在其中一塊放牧場地放牧?xí)r發(fā)生，另一牛群正常。今年發(fā)病牛日齡在9月齡左右，尚未放牧，僅在舍飼期間就發(fā)生了。突然發(fā)病，來不及治療。均表現(xiàn)為前肢肩關(guān)節(jié)（肘部）肌肉腫脹，然后迅速蔓延，向小腿及背部，可見肘部皮膚明顯突起，用手指按壓可聽到清晰地捻發(fā)音。病牛初期跛行，患病肢不敢著地，精神沉郁，厭食，體溫升高達41℃。后期癱瘓，病程2～3 d死亡。病中消瘦。剖檢觀察切開的肘部腫脹肌肉可見皮下炎性水腫，呈黃色膠凍狀，肌肉出血，呈黑色。肌肉間有蜂窩狀空泡。皮下膠凍狀浸潤至腕關(guān)節(jié)上部至頸及脊柱。脾臟未見異常。腎臟表面有出血，白色壞死灶。肝臟腫大。膽囊腫大。膽汁呈綠色。小腸黏膜增生。肺臟左側(cè)心葉有化膿灶，呈化膿性肺炎及小葉性肺炎。另一側(cè)未見異常。

從病死牛的肌肉內(nèi)分離到一種呈梭狀或者湯勺狀的革蘭氏染色陽性桿菌。同時對分離菌株進行生物學(xué)特征性檢查，生化試驗，16S rDNA系統(tǒng)進化分析，以及藥物敏感性試驗，結(jié)果證實該分離株屬于氣腫疽?，F(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下。

1 材料

1.1 病料

2015年，內(nèi)蒙古某牛場爆發(fā)疑似氣腫疽疫病，無菌采集新病死牛的肌肉，腸。標記并放入無菌培養(yǎng)皿中。

1.2 培養(yǎng)基

新鮮的10%的綿羊血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在無菌條件下按常規(guī)方法制備，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。厭氣肝湯培養(yǎng)基自己制作。

1.3 主要試劑

Premix Taq和DNA Marker（2000）均購自TaKaRa公司；上下游引物與瓊脂糖購自上海生工；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自杭州愛思進生物有限公司。細菌微量生化反應(yīng)管和常用藥敏試紙均購自杭州天和微生物試劑有限公司，批號分別為：140311和150401。 1.4試驗動物

健康昆明系小白鼠5只，30～40 g，購自哈藥集團黑龍江省生物制品一廠。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng)

將肌肉和腸內(nèi)容物分別接種于新制備的血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在焦性沒食子酸和氫氧化鈉反應(yīng)缸里完全厭氧的條件下培養(yǎng)。并且將病變的肌肉組織接種于厭氣肝湯中，封上石蠟。37℃培養(yǎng)12～24 h。觀察血液瓊脂培養(yǎng)基菌落的形態(tài)及生長狀況，觀察厭氣肝湯渾濁產(chǎn)氣情況，在血液瓊脂培養(yǎng)基上挑取可疑菌落純培養(yǎng)。

2.2 生化試驗

選取葡萄糖、蔗糖、靛基質(zhì)、尿素、甘露醇和半乳糖等15種微量生化反應(yīng)管。抽取渾濁的厭氣肝湯1 mL于離心管中，12 000 rpm離心1 min，棄掉上清，用滅菌接種環(huán)蘸取管底沉淀并分別接種于各反應(yīng)管中，上部用石蠟封上。37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

2.3 細菌16S rDNA PCR擴增以及鑒定

2.3.1 引物設(shè)計16S rDNA分子大小適中，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性和存在的普遍性，人們根據(jù)這些保守區(qū)，設(shè)計PCR通用引物，這樣可以用來擴增出所有細菌的16S rDNA片段。若在可變區(qū)設(shè)計特異性引物，則可區(qū)分不同細菌。它既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列。根據(jù)Lane等的報道合成擴增細菌16S rDNA的通用引物擴增的DNA片段約1.7kb，引物如下[4-5]：

上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′8-27

下游引物5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′1512-1492

α、β、ε和l 4種毒素的16S rDNA的通用引物擴增的DNA片段分別為324 bp、196 bp、655 bp和446 bp。

α毒素上游引物5′-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3′

下游引物5′-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3′

β毒素上游引物5′-GCGAATATGCTGAATCATCTA-3′

下游引物5′-GCAGGAACATTAGTATATCTTC-3′

ε毒素上游引物5′-GCGGTGATATCCATCTATTC-3′

下游引物5′-CCACTTACTTGTCCTACTAAC-3′

l毒素上游引物5′-ACTACTCTCAGACAAGACAG-3′

下游引物5′-CTTTCCTTCTATTACTATACG-3′

2.3.2 細菌基因組DNA提取參照參考文獻[6]進行細菌基因組制備。

2.3.3 菌體DNA制備和PCR反應(yīng)煮沸法進行細菌基因組制備。采用25μL反應(yīng)體系：PremixTaq12.5 μL，上下游引物各為0.5 μL，DNA模版2 μL，補充去離子水至總體積為25 μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5 min，25個循環(huán)（94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸2 min），72℃延伸10 min。用EB染色1%的瓊脂糖凝膠，在1×TAE電泳液中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc 2000）中觀察擴增結(jié)果。

2.3.4 PCR產(chǎn)物16S rDNA測序分析將大量擴增分離株16S rDNA，用DNA凝膠回收試劑盒（Biospin Gel Extraction Kit）回收DNA。北京華大基因研究中心測序，將序列進行同源性的百分率比較，應(yīng)用DNAStar軟件中的ClustaⅡ方法。繪制系統(tǒng)進化樹，然后把分離株與其他菌株的親緣關(guān)系進行分析。

2.3.5 PCR毒力檢測與PCR擴增細菌16S rDNA相同的反應(yīng)體系，測定是否含有α、β、ε、l毒素。

2.4 藥敏試驗

取蒽諾沙星、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、卡那霉素和萬古霉素等藥敏片進行藥敏試驗，實驗按常規(guī)方法操作。37℃完全厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。

2.5 動物接種試驗

將在厭氣肝湯中分離得到的菌液注射到3只小鼠體內(nèi)各0.5 mL，1只作為對照只注射0.5 mL厭氣肝湯。記錄小鼠精神狀態(tài)、毛色、進食進水情況、死亡數(shù)量及死亡時間。

3 結(jié)果與分析

3.1 細菌學(xué)檢查結(jié)果

經(jīng)血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，可見在培養(yǎng)基上長出大的、透明并有β溶血的菌落（見圖1）；在厭氣肝湯培養(yǎng)基中，肉湯均勻渾濁產(chǎn)氣。革蘭氏染色陽性、桿狀。無莢膜和芽孢（見圖2）。

圖1 Clostridium chauvoei在培養(yǎng)基厭氧條件下培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Clostridium chauvoei cultured 24 hour under the condition of anaerobic of agar medium with blood

圖2 Clostridium chauvoei革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Results of Gram staining for Clostridium chauvoei

3.2 生化試驗結(jié)果

經(jīng)鑒定得到的結(jié)果見表1?？梢姶蟛糠稚c參考文獻[7]結(jié)果相符。

表1 生化試驗結(jié)果Table 1 The results of biochemistry

3.3 細菌16S rDNA PCR擴增以及毒力測定結(jié)果

3.3.1 細菌16S rDNA PCR擴增結(jié)果分離株應(yīng)用PCR方法擴增出分離菌株的部分16S rDNA基因片段，目的片段大小約為1.7 kb，結(jié)果見圖3。

圖3 分離菌株16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.3 Results of isolated strains 16S rDNA

3.3.2 分離菌株P(guān)CR毒力測定1和2為α毒素320 bp和β毒素190 bp的DNA片段。3和4為ε毒素和l毒素沒有目的片段。見圖4。

圖4 分離菌株毒素測定結(jié)果Fig.4 Results of isolated strains toxin

3.3.3 分離菌株16S rDNA基因片段測序結(jié)果同源性比較結(jié)果經(jīng)測序得出結(jié)果進行同源性比較分析發(fā)現(xiàn)分離株16S rDNA基因序列與C.chauvoei2585，C. chauvoeiATCC10092T，C.chauvoeiCC4，C.chauvoeiCC7和C.chauvoeiisolate CC7同源性最高，相似性都在90%以上，最高達95.8%。與C.haemolyticum菌株和C.septicum等菌株同源性較遠，分離株也與其他的菌株差異性較大。各分離菌株與GeneBank上菌株16S rDNA基因序列同源性比較結(jié)果見圖5。

圖5 各個菌株之間16S rDNA基因序列比較結(jié)果Fig.5 The results of 16S rDNA genes sequence comparison between different strains

3.3.4 系統(tǒng)進化樹分析分離菌株16S rDNA基因片段測序后的結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件中ClustaⅡ方法將測序結(jié)果與GeneBank上的相似序列繪制系統(tǒng)進化樹后進行分析發(fā)現(xiàn)，分離株16S rDNA基因序列雖與C.chauvoei菌株和C.septicum菌株在同一群，但與和已經(jīng)報道的C.chauvoeiCC7、C.chauvoeiisolateCC7、C.chauvoeiCC4C.chauvoei2585和C.chauvoeiATCC10092T菌株親緣關(guān)系還是比較遠；與C. perfringens菌株和C.haemolyticum等菌株的親緣關(guān)系更遠。詳細的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果見圖6。

圖6 分離菌株與GeneBank上菌株之間16S rDNA基因進化分析結(jié)果Fig.6 The analysis result of gene evolution about 16S rDNA between the isolated strains and that in GeneBank

3.4 藥敏試驗

根據(jù)藥物敏感性試驗確定分離菌株對環(huán)丙沙星、蒽諾沙星藥物高度敏感，而對克林霉素、四環(huán)素、先鋒必等藥物具有耐藥性。

3.5 動物接種試驗

4只小白鼠接種分離菌株后，沒有發(fā)生死亡。一個星期內(nèi)均沒發(fā)現(xiàn)異常。

4 小結(jié)與討論

實驗成功分離到氣腫疽梭菌。并且詳細介紹了引起氣腫疽的病例；藥物敏感性試驗表明分離的Clostridium chauvoei對蒽諾沙星、環(huán)丙沙星等藥物高度敏感。而對四環(huán)素、萬古霉素、桿菌肽等具有耐藥性。動物試驗小鼠并沒有死亡，是由于本菌對豚鼠最易感，倉鼠也易感，而小鼠次之[8]。通過進化分析該分離株雖與已被報道的氣腫疽同源性高，但還存在一定的差異。所以，還需對這一梭菌做進一步分析。研究是否現(xiàn)有疫苗對該菌株具有免疫原性或與其他菌株存在哪些差異，并為該病的疫苗研制提供了候選株，用于防控該病具有重要意義。

2006年在日本出現(xiàn)了人感染氣腫疽導(dǎo)致死亡的事件，雖不能確定氣腫疽是否會感染免疫力正常的人類。但有效的做好防護措施也是非常有必要的[9]。氣腫疽梭菌的芽孢具有很強的抵抗力，可以在土壤里存活5年以上。腐尸中也可存活3個月[10]。對于患病地區(qū)，畜舍、場地、用具等需全面消毒，尸體以及被污染的飼料和糞尿要一起進行焚毀與深埋。牛群轉(zhuǎn)移放牧地點并進行緊急免疫接種[11]。只有建立比較健全的氣腫疽綜合防治體系，并做好防治工作，才能有效控制和減少該病的發(fā)生[12]。如遇本病要提早治療，避免造成病牛死亡，帶來經(jīng)濟損失。該牛群可以采用蒽諾沙星灌服或磺胺類藥物的使用。盡量不要再去那個牧場放牧。

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Isolation，Identification and Phyletic Evolution Analysis of Clostridium chauvoei HLJ-1 Strain

Zhou Jinling，Wu Dandan，Zhou Yulong，Zhu Zhanbo，Pao Fanze（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）

In June，2015，a suspected Blackleg disease broke out in a certain dairy farm in Inner Mongolia.To effectively prevent and control this disease，an inflammatory muscle was aseptic collected to isolate and identify aerobic and anaerobic bacteria and then was performed drug sensitive test.The gram-positive decapsulated bacilli with both ends obtus was isolated from the muscle of the diseased cattle.The phaenotype features and the results of biochemistry experiments showed that the obtained bacterium was very similar to Clostridium chauvoei.The result of 16S rDNA sequence analysis exhibited its homology with C.chauvoei from GenBank was up to 95.8%.Toxicity testing indicated that it contained toxins α.These findings suggested that this strain was Clostridium chauvoei.Drug testing showed that it was hypersensitive to enrofloxacin base and ciprofloxacin.This study provided theoretical basis and material basis for prevention and control of this disease.

bovini；Clostridium chauvoei；isolation；identification

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0083-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.017

2015-09-10

黑龍江省教育廳項目（12531471）。

周金玲（1992-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2015級碩士研究生。

周玉龍，男，副教授，E-mail：zhouyulong1980@163.com。