岳山，劉宇，2，劉通，周金玲，王華欣，趙靜虎，何泊寧，劉珊珊，張世勛，王天，劉增祿，朱戰(zhàn)波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

黑龍江某牛場腹瀉犢牛大腸桿菌致病株分離鑒定及耐藥性和耐藥基因檢測

岳山1，劉宇1，2，劉通1，周金玲1，王華欣1，趙靜虎1，何泊寧1，劉珊珊1，張世勛1，王天1，劉增祿1，朱戰(zhàn)波1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

為了解黑龍江省綏化市某規(guī)模化奶牛場腹瀉犢牛大腸桿菌分離株的耐藥性及耐藥基因攜帶情況，在2016年4月，收集該牛場群發(fā)腹瀉犢牛的8份糞便，通過細(xì)菌分離鑒定，生化實(shí)驗(yàn)等鑒定方法，確定牛群腹瀉的病因?yàn)榇竽c桿菌感染。結(jié)果顯示對氟苯尼考，多粘菌素B高度敏感，對青霉素具有較強(qiáng)的耐藥性，耐藥率達(dá)100%，其四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星耐藥率達(dá)75%；應(yīng)用PCR方法檢測大腸桿菌耐藥基因，共檢出5種耐藥基因，分別為blaTEM、tetA、Sul2、aac（3）-Ⅱ、ParC。表明該牛場大腸桿菌分離株的耐藥現(xiàn)象特別嚴(yán)重，提示該養(yǎng)殖場應(yīng)合理使用抗生素。

犢牛；大腸桿菌；藥敏試驗(yàn)；PCR；耐藥基因

引起犢牛腹瀉的病原較多，包括輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒、沙門氏菌、空腸彎曲菌、大腸桿菌等，大腸桿菌是常見的細(xì)菌性病原，可引起犢牛腹瀉、泌乳牛乳房炎、犢牛或育成牛腸毒血癥等。近幾年來，隨著養(yǎng)牛規(guī)模的擴(kuò)大和集約化生產(chǎn)程度的提高，犢牛腹瀉的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢[1]，其中由致病性大腸桿菌引起的約占90%[2]，給養(yǎng)殖場帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

大腸桿菌病的防治以抗生素治療為主，臨床常用青霉素、鏈霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星等藥物。隨著抗生素的廣泛使用，大腸桿菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。目前，大腸桿菌超級菌株、食品中毒、廣譜耐藥等問題已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)，監(jiān)測動物源大腸桿菌耐藥性具有重要的公共衛(wèi)生意義[3]。因此對牛源大腸桿菌耐藥性的調(diào)查與耐藥基因檢測，了解牛場常用藥物，對于預(yù)防和控制牛大腸桿菌病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

無菌采集腹瀉糞樣8份，并對其進(jìn)行編號，然后放置-20℃保存待檢。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、革蘭氏染色液、Marker DL2000購自TaKaRa公司、TaqMasterMix購自康為世紀(jì)有限公司、革蘭氏染色液安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司、藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922來自本實(shí)驗(yàn)室保存。生化管、藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生物技術(shù)公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

引入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)[4-8]進(jìn)行設(shè)計(jì)引物（見表1），引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 peimer sequence

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定

用無菌接菌環(huán)沾取少量糞便在普通營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行劃線37℃培養(yǎng)18 h后取出，挑取疑似大腸桿菌的菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)18 h，挑取麥康凱上的紅色單菌落接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生成帶黑色金屬光澤的菌落進(jìn)行營養(yǎng)瓊脂平板純化。

1.2.2 染色鏡檢

挑取純化后普通營養(yǎng)瓊脂平板上生成的單個(gè)菌落進(jìn)行涂片染色鏡檢。

1.2.3 生化鑒定

鏡檢符合大腸桿菌形態(tài)特征的菌體采用腸桿菌科生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）藥敏紙片擴(kuò)散法法規(guī)。并用藥敏質(zhì)控株ATCCA25922作為對照。

1.2.5 細(xì)菌基因組DNA的提取

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行按步操作提取細(xì)菌DNA。

1.2.6 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

設(shè)置一個(gè)25 μL反應(yīng)體系，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，TaqMasterMix 12.5 μL，去離子水9.5 μL；PCR擴(kuò)增條件為95℃5 min，94℃30 s，55℃1 min，72℃1 min擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物加于1.0%瓊脂糖凝膠中，用凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

在普通營養(yǎng)瓊脂上生成灰白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上生成紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生成帶黑色金屬光澤的菌落。

2.2染色鏡檢結(jié)果

鏡檢為革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓、短桿狀、單個(gè)或成對存在。

2.3 生化鑒定

大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖，部分菌株不分解蔗糖；靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)、甲基紅、MR試驗(yàn)陽性均為陽性；VP試驗(yàn)陰性；枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，通過伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[9]，以上檢測試驗(yàn)結(jié)果菌均符合大腸桿菌生化反應(yīng)特性。

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在分離到的8份大腸桿菌中，大腸桿菌除對多粘菌素B敏感外均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，其中對青霉素全部耐藥，對阿莫西林、氨芐西林、頭孢唑林等耐藥率高達(dá)87.5%，對鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星的耐藥率高達(dá)75%。其具體結(jié)果見表2。

表2 大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitive test results of E.coli

2.5 PCR檢測結(jié)果

對6種耐藥基因進(jìn)行檢測，共檢測出5種耐藥基因，其中aadB耐藥基因未能檢出，在檢出的5種耐藥基因陽性檢出率均為100%，以下是5種耐藥基因PCR結(jié)果圖（見圖a～e）。

3 討論

近年來，由于抗生素的廣泛使用，尤其在臨床和動物養(yǎng)殖業(yè)中的不合理使用，使得大腸桿菌耐藥性日益嚴(yán)重，并有逐年上升趨勢，細(xì)菌耐藥菌株的傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)是導(dǎo)致傳染病治愈率受到限制的主要原因之一。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明所有分離株對青霉素全部耐藥，阿莫西林、氨芐西林、頭孢唑林的耐藥率也高達(dá)87.5%，這與牛場長期使用青霉素類藥物治療疾病有關(guān)。武瑞兵等[10]對117份肉牛大腸桿菌進(jìn)行耐藥性與耐藥基因檢測，結(jié)果117株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、鏈霉素耐藥率分別為89%、42%和38%，除四環(huán)素檢出率低于89%外，其余均高于武瑞兵等人的報(bào)道，馬長賓等[11]在192份大腸桿菌奶牛犢牛腹瀉樣品中，青霉素的耐藥率達(dá)82%，鏈霉素耐藥率達(dá)69%，與試驗(yàn)檢測鏈霉素耐藥率相接近，說明大腸桿菌在牛群中的耐藥性增強(qiáng)。

試驗(yàn)在8份樣品中檢測出5種耐藥基因其檢出率均為100%，由于菌株數(shù)量較少，與其他等人報(bào)的大腸桿菌耐藥基因檢出率相比較都偏高。武瑞兵等[8]在26株磺胺類耐藥菌株中sul2基因檢出率77%（22/26），在104株大腸桿菌耐四環(huán)素菌株中tetA基因檢出率為55%（57/104），耐β-內(nèi)酰胺菌株中blaTEM73%（36/49），而試驗(yàn)兩種耐藥基因檢出率為100%，說明青霉素和四環(huán)素在治療大腸桿菌病時(shí)使用率較高，不同地區(qū)牛場使用抗生素有所差別，導(dǎo)致耐藥性和耐藥基因比率也各不相同在[12]。實(shí)驗(yàn)ParC檢出率為100%，說明在治療大腸桿菌病過程中喹諾酮類藥物使用廣泛，造成耐藥性逐漸增強(qiáng)，加快了耐藥基因傳播速率。通過藥敏試驗(yàn)與檢出的耐藥基因相比，有兩株菌表現(xiàn)出不耐藥，但確檢測出aac（3）-Ⅱ、ParC耐藥基因，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

圖15 種耐藥基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of 5kinds of drug-resistant genes

大腸桿菌耐藥性和耐藥基因檢測結(jié)果進(jìn)一步肯定了在畜牧業(yè)中抗菌藥物的使用對大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義。為養(yǎng)殖場合理用藥，避免產(chǎn)生新的耐藥菌株和預(yù)防耐藥性繼續(xù)擴(kuò)散提供了參考依據(jù)。

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Isolation Identification and Detection of Drug Resistance and Resistance Gene of Pathogenic Escherichia coli Strains Isolated from Cattle Farm in Heilongjiang Province

Yue Shan1，Liu Yu1，2，Liu Tong1，Zhou Jinling1，Wang Huaxin1，Zhao Jinghu1，He Boning1，Liu Shanshan1，Zhang Shixun1，Wang Tian1，Liu Zenglu1，Zhu Zhanbo1
（1.College of Anmimal Science and Technology，Heilongjiang Bayi agriculture university，Daqing 163319;
2.Veterinary Science Research Institute of Heilongjiang Province）

To studydrug resistance and resistance gene of Escherichia coli strains isolated from diarrhealcalves in large scale dairy farm of Suihua city in Heilongjiang province，in April 2016，8 fecal collections were collected from diarrheal calves.The reason of diarrhea disease was the infection of Escherichia coli confirmed by isolation and identification of bacteria，and biochemical test identification methods.Drug susceptibility test results showed that Escherichia coli stains were highly sensitive to fluorine benzene nicol and polymyxin B，resistance of penicillin was 100%，tetracycline ciprofloxacin and enrofloxacinwas 75%.Escherichia coli stains contained five drug resistance genes by PCR，such as blaTEMtetA Sul2 aac（3）-II and ParC.Results showed that resistance phenomenon of Escherichia coli strains was particularly serious in the largescale dairy farm，and antibiotics should be rationally used.

calves；Escherichia coli；drug sensitivity test；drug resistance gene

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0079-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.016

2015-08-10

科技部科技支撐計(jì)劃課題（2014BAD13B03-1）；省農(nóng)墾總局課題（HNK135-04-03）。

岳山（1991-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2015級碩士研究生。

朱戰(zhàn)波，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhanbozhu@163.com。