劉通，劉宇，2，趙靜虎，王華欣，周金玲，岳山，何泊寧，劉珊珊，張世勛，王天，劉增祿，朱戰(zhàn)波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

黑龍江某規(guī)模化場奶牛急性乳房炎病原分離鑒定與藥敏實驗

劉通1，劉宇1，2，趙靜虎1，王華欣1，周金玲1，岳山1，何泊寧1，劉珊珊1，張世勛1，王天1，劉增祿1，朱戰(zhàn)波1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

2016年5月，黑龍江省某規(guī)?；霰l(fā)急性乳房炎，為確診其病因，無菌采取10份乳樣進行細(xì)菌的分離鑒定，并對分離菌株進行培養(yǎng)特性檢查、生化試驗鑒定和藥敏試驗。經(jīng)檢查10份乳樣中大腸桿菌單獨感染1例，葡萄球菌單獨感染1例，鏈球菌單獨感染1例，葡萄球菌和鏈球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例。該研究為該牛場奶牛乳房炎的病因分析和防治提供了指導(dǎo)。

奶牛乳房炎；細(xì)菌分離鑒定；藥敏試驗

乳房炎是奶牛最重要的常見疾病之一，可引起產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過135種病原可引起乳房炎，根據(jù)有無臨床癥狀可將奶牛乳房炎分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎兩種[1]。奶牛乳房炎的主要病原包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和支原體等，環(huán)境性鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌、沙門氏菌、綠膿桿菌等也可引起乳房炎[2-3]。病原菌損害乳房的泌乳組織，給養(yǎng)牛業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失[4]。

2016年5月，黑龍江省肇東市某規(guī)?；瘓霰l(fā)了奶牛急性乳房炎，10余頭奶牛出現(xiàn)乳腺炎癥。為了確定本次發(fā)病的病因，進行了病牛乳樣的細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與試劑革蘭氏染色液、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基，各種細(xì)菌培養(yǎng)基生化試驗管及藥敏片均購于杭州天和微生物試劑有限公司。1.1.2病料無菌采集10份乳樣，每份2 mL，放入4℃冰箱低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷部分奶牛乳房出現(xiàn)紅腫熱痛癥狀，擠奶乳汁出現(xiàn)絮狀物，產(chǎn)奶量下降或產(chǎn)奶停止等癥狀。

1.2.2 細(xì)菌分離將采集的10份乳樣每個取1 mL離心去上清液取沉淀30 μL涂布在綿羊血液瓊脂平板上，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，觀察菌落形態(tài)和生長情況[5]。取生長的單個菌落進行純化培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢。取結(jié)果為革蘭氏陰性菌分別接種在麥康凱伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，取結(jié)果為革蘭氏染色陽性菌接種甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基并進行觸酶試驗及兔血漿凝固酶實驗[6]。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定經(jīng)染色鏡檢符合大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌特征的菌株，用接種環(huán)挑取單個菌落純培養(yǎng)物分別接種于到對應(yīng)生化管中，37℃培養(yǎng)24～36 h后，觀察結(jié)果并記錄。

1.2.4 藥敏試驗取營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)后的菌液，用移液槍吸取100 μL均勻涂抹到整個營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，貼藥敏片，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h，后判定結(jié)果參照美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）藥敏紙片擴散法法規(guī)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

通過革蘭氏染色鏡檢及菌落形態(tài)分離出4種細(xì)菌，第一種為革蘭氏陰性兩端鈍圓粗短的無芽孢小桿菌，多數(shù)單個散在，個別成雙排列。由乳樣涂血平板培養(yǎng)后，形成光滑、半透明、白色菌落。第二種革蘭氏染色均為單個成對或成葡萄串狀革蘭氏陽性球菌。菌落呈圓形，表面光滑凸起，有透明溶血環(huán)呈β溶血。第三種為革蘭氏陽色菌呈圓形或卵圓形，鏈狀或成雙，菌落呈圓形，表面光滑凸起，呈α溶血。第四種革蘭氏染色陽性，呈橄欖球狀菌，菌落大而厚，表面光滑、濕潤、黏稠，容易挑起，質(zhì)地均勻，呈乳白色。

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.2.1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

革蘭氏陰性短桿菌在EMB培養(yǎng)基平板上菌落呈黑色帶有金屬光澤，在MAC培養(yǎng)基平板上菌落呈紅色或粉紅色，符合大腸桿菌特異性[8]。將G+球菌涂布在高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基上，致病性葡萄球菌能產(chǎn)生黃色的菌落[9]。血漿凝固酶實驗：取兔血漿2 mL加入0.4 mL孵育14 h的肉湯培養(yǎng)物，置37℃溫箱培養(yǎng)，每隔2 h觀察，至8 h血漿凝固[10]。觸酶試驗：金黃色葡萄球菌的菌株觸酶試驗有氣泡產(chǎn)生。

圖1 大腸桿菌革蘭氏染色鏡檢Fig.1 Gram-stained E.coli stained microscopy

圖2 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色鏡檢Fig.2 Staphylococcus aureus Gram staining

圖3 停乳鏈球菌革蘭氏染色鏡檢Fig.3 Streptococcus dysgalactiae Gram stain staining

圖4 酵母菌革蘭氏染色鏡檢Fig.4 Yeast Gram stain microscopy

圖5 大腸桿菌血平板菌落形態(tài)Fig.5 E.coli on blood plate

圖6 大腸桿菌EMB平板菌落形態(tài)Fig.6 E.coli on EMB plate

圖7 大腸桿菌MAC平板菌落形態(tài)Fig.7 E.coli on MAC plate

圖8 金黃色葡萄球菌血平板菌落形態(tài)Fig.8 SA on blood plate

圖9 高鹽甘露醇平板菌落形態(tài)Fig.9 SA on MSA plate

圖10 停乳鏈球菌平板菌落形態(tài)Fig.10 Streptococcus dysgalactiae on blood plate

圖11 兔血漿凝固酶實驗Fig.11 Rabbit plasma coagulase experiment

圖12 觸酶實驗Fig.12 Tests for catalase

2.2.2 生化試驗結(jié)果所分離的菌株其生化反應(yīng)結(jié)果。大腸桿菌生化鑒定結(jié)果：枸櫞酸鹽、尿素、VP陰性，精氨酸雙水解酶、乳糖、果糖、棉膠糖、山梨醇、鼠李糖、靛基質(zhì)、苯丙氨酸、衛(wèi)矛醇、阿拉伯糖陽性。金黃色葡萄球菌生化鑒定結(jié)果：葡萄糖、松二糖、β-半乳糖苷（ONPC）、蕈糖陰性，硝酸鹽（還原）、精氨酸雙水解酶、尿素、乳糖、果糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖、核糖、DNA、麥芽糖、蔗糖陽性。停乳鏈球菌生化鑒定結(jié)果：馬尿酸鈉、七葉苷、菊糖、棉實糖、甘露醇、水楊苷、6.5%Nacl生長陰性，乳糖、海藻糖陽性。均符合對應(yīng)細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果。

2.2.3 藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果表明如表1所示。

表1 藥敏試驗結(jié)果（單位：mm）Table 1 Drug sensitivity test results（unit：mm）

分離出的四種細(xì)菌，根據(jù)其抑菌環(huán)大小可以判斷大腸桿菌對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明高度敏感，對慶大霉素、強力霉素、氯霉素中度敏感。金葡球菌對氯霉素、阿莫西林、頭孢噻吩高度敏感，對慶大霉素、強力霉素、復(fù)方新諾明中度敏感。停乳鏈球菌菌對阿莫西林、克林霉素極度敏感，頭孢噻吩、慶大霉素、氯霉素高度敏感。

3 討論

根據(jù)臨床癥狀和乳樣變化，細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定，生化試驗。綜上所述可診斷出該場10份乳樣中大腸桿菌單獨感染1例，葡萄球菌單獨感染1例，鏈球菌單獨感染1例，葡萄球菌和鏈球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例。這幾種細(xì)菌導(dǎo)致奶牛發(fā)病與飼養(yǎng)時環(huán)境衛(wèi)生有很大關(guān)系?？刹捎萌碇委煟o注）配合局部治療（乳區(qū)灌注），應(yīng)選擇敏感性較高藥物如阿莫西林、環(huán)丙沙星，進行乳頭灌注治療，連續(xù)用藥5～7 d。

酵母菌多引起奶牛隱性乳房炎，長期使用廣譜抗生素是其誘因，當(dāng)大劑量反復(fù)使用抗生素后，對抗生素敏感的細(xì)菌被抑制或殺死，乳頭附近的菌群平衡狀態(tài)被破壞，從而使酵母菌乘機大量增殖。酵母菌和葡萄球菌混合感染用咪康唑治療，全群產(chǎn)奶牛連續(xù)做三次以上隱性乳房炎治療，徹底凈化運動場。直至把隱性乳房炎將至15%以下，然后再單獨對隱性乳房炎進行治療，乳房炎高發(fā)季節(jié)（每年的4～10月份），應(yīng)做全群預(yù)防[11]。

［1］鄧海平，蒲萬霞，俞詩源，等.奶牛乳房炎主要病原菌及其分離鑒定方法研究進展［J］.中國草食動物，2009，29（2）：52-55.

［2］任鳳蘭，吳海燕，關(guān)海峰.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2003，15（3）：64-66.

［3］孫建萍.奶山羊乳腺炎的防治經(jīng)驗［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2014（3）：57-59.

［4］J?rgensen H J，Mathisen T，L?vseth A，et al.An outbreak of staphylococcal food poisoning caused by enterotoxin H in mashed potato made with raw milk［J］.Fems Microbiology Letters，2005，252（2）：267-272.

［5］王曉，王新，郝丹，等.奶牛乳源大腸桿菌耐藥性、毒素基因鑒定及PFGE分型研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2014，45（3）：463-470.

［6］冉多良，王愛冬.野生巖羊金黃色葡萄球菌分離與鑒定［C］//.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第十二次學(xué)術(shù)研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2007.

［7］Wang S，Zhang P Y，Liu Y，et al.Susceptibility Testing of the Combination of enrofloxacin and kanamycin against Some Pathogenic Bacteria of Dairy Cow Mastitis［J］.China Dairy Cattle，2014（9）：23-25.

［8］李路，劉繼超，姜鐵民，等.北京地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場中大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析［J］.中國乳品工業(yè)，2014，42（12）：7-9.

［9］馬保臣，秦卓明，蔡玉梅，等.多重PCR檢測奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和酵母菌方法的建立與應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37（11）：1202-1208.

［10］徐昊，孫海英，翟軍軍，等.大慶屠宰牛肉中沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2015，27（3）：36-39.

［11］欒正慶.奶牛酵母菌性乳房炎的快速診斷及中藥治療［J］.中國動物保健，2015（9）：51-52.

Identification of Dairy Cattle Mastitis Pathogens and Drug Sensitive Test in Certain Intensive Dairy Farm in Heilongjiang Province

Liu Tong1，Liu Yu1，2，Zhao Jinghu1，Wang Huaxin1，Zhou Jinling1，Yue Shan1，He Boning1，Liu Shanshan1，Zhang Shixun1，Wang Tian1，Liu Zenglu1，Zhu Zhanbo1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；
2.Veterinary Science Research Institute of Heilongjiang Province）

In May 2016，a mastiffs broke out in a dairy farm in Heilongjiang province，to diagnose its cause，it took 10 cases aseptic samples for bacterial isolation and identification of the culture characteristics of the isolated strains and biochemical tests and drug susceptibility testing.In 10 samples，Escherichia coli infection in 1 case，Staphylococcus infection in 1 case，Streptococcus infection in 1 case，Staphylococcus aureus and Streptococcus mixed infection in 4 cases，Staphylococcus aureus and Yeast mixed infection in 2 cases.This study provided a guide to prevention and treatment of dairy cattle mastitis.

dairy cattle mastitis；bacterial isolation and identification；susceptibility test

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0065-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.013

2015-08-10

黑龍江省科技廳課題（GC13B402）。

劉通（1993-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2015級碩士研究生。

朱戰(zhàn)波，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhanbozhu@163.com。