曹宇，李蘭，張洪友

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

集約化牛場泌乳奶牛硒缺乏癥血液臨床病理學(xué)變化研究

曹宇1，李蘭2，張洪友1

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

從兩個(gè)集約化奶牛場（A、B），選取了缺硒組（30頭）與健康對(duì)照組（20頭），檢測試驗(yàn)?zāi)膛５目寡趸?、免疫功能、肝功指?biāo)。結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組相比，缺硒組血漿中GSH-Px活性顯著的降低，與硒水平呈顯著正相關(guān)；MDA、T-NOS和LPO水平明顯升高，MDA、T-NOS、LPO與硒水平呈顯著負(fù)相關(guān)。缺硒組血漿中IL-1β、IgG、TNF-α和IL-6水平都顯著的降低（P＜0.05），TNF-α、IL-6、IgG、IL-2與硒水平呈顯著正相關(guān)。缺硒組血漿中ALP、TP水平明顯的增加，ALP、TP與硒水平呈顯著負(fù)相關(guān)。表明硒缺乏癥會(huì)影響泌乳奶?？寡趸芰兔庖吖δ堋?/p>

奶牛；硒缺乏；抗氧化；免疫功能；肝功

硒缺乏癥是泌乳奶牛的一種重要的營養(yǎng)代謝病。它會(huì)引起泌乳期奶牛產(chǎn)奶量降低，免疫功能低下，并繼發(fā)其他疾病如乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等。近年來，我省集約化牛場奶牛單產(chǎn)不斷提高，亞臨床代謝病時(shí)有發(fā)生，危害日趨嚴(yán)重。硒缺乏會(huì)對(duì)機(jī)體的抗氧化能力，繁殖性能及生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響。目前，反芻動(dòng)物硒缺乏還沒有受到人們的廣泛關(guān)注及研究。實(shí)驗(yàn)通過檢測奶牛血漿中硒含量，為硒缺乏對(duì)奶牛繁殖性能和泌乳性能的影響做進(jìn)一步研究。并通過對(duì)泌乳奶牛抗氧化、肝功及細(xì)胞因子等指標(biāo)進(jìn)行檢測，并將硒含量和氧化應(yīng)激指標(biāo)、細(xì)胞因子、肝功指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，探究泌乳奶牛硒與抗氧化能力，免疫功能和肝功的相關(guān)性，為泌乳奶牛提早補(bǔ)硒提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

在牧場A和牧場B兩個(gè)不同區(qū)域的集約化牛場中，以血清硒小于70 μg·L-1為缺硒標(biāo)準(zhǔn)，選取30頭硒缺乏奶牛作為缺硒組，選取20頭健康奶牛作為健康對(duì)照組（血漿硒含量在正常范圍的泌乳奶牛頭數(shù)較少，為了保持缺硒組與健康對(duì)照組數(shù)量上的大致平衡，在兩牛場隨機(jī)選取80頭進(jìn)行生化指標(biāo)樣品檢測）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和試劑盒

肝素抗凝劑購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）生化試劑盒（20131115）、超氧化物歧化酶（SOD）生化試劑盒（20131115），丙二醛（MDA）生化試劑盒（20131119）、一氧化氮（NO）生化試劑盒（20131119）、過氧化氫酶（CAT）生化試劑盒（20131115）、總一氧化氮合成酶（T-NOS）試劑盒（20140906）、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA測定試劑盒（201409）、白介素-1受體（IL-1β）ELISA測定試劑盒（201409）、白介素-2（IL-2）ELISA測定試劑盒（201409）、過氧化脂質(zhì)（LPO）生化試劑盒（20140829）、免疫球蛋白G（IgG）ELISA測定試劑盒（201409）、白介素-6（IL-6）ELISA測定試劑盒（201409），以上試劑盒均購自南京建成生物有限公司。

1.3 樣品采集

牧場A和牧場B，清晨空腹尾靜脈采集試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ簶悠罚嗡乜鼓裳?0 mL，4 000 rmp·min-1離心，取上清液，-80℃凍存，備用。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

首先檢測樣品硒含量以確定缺硒組和對(duì)照組，之后兩組血液樣品檢測項(xiàng)目包括抗氧化（GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA、T-NOS、LPO、NO、CAT）、免疫功能（TNF-α、IL-6、IgG、IL-1β、IL-2）、肝功（ALB、ALP、TP、GLB、A/G）的各項(xiàng)指標(biāo)。

硒采用原子吸收方法檢測，SOD（U·mL-1）采用比色法檢測，MDA（nmol·mL-1）采用硝酸還原酶法檢測、NO（μmol·L-1）采用硝酸還原酶法檢測、TP（g·L-1）采用比色法檢測；ALB（g·L-1）采用比色法檢測。CAT（U·mL-1）采用可見光法檢測、T-NOS（U·mL-1）采用比色法檢測、T-AOC（U·mL-1）采用比色法檢測、GSH-Px（U·mL-1）采用比色法檢測、LPO（μmol·mL-1）采用分光光度法檢測，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行（操作方法見附錄），上述指標(biāo)均在南京建成生物技術(shù)有限公司檢測。IL-1β（ng·L-1）、IL-2（ng·L-1）、IL-6（ng·L-1）、TNF-α（ng·L-1）、IgG（mg·mL-1）采用酶聯(lián)免疫分析方法檢測，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明執(zhí)行，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔和樣品孔均設(shè)對(duì)照孔，上述指標(biāo)均在南京建成生物技術(shù)有限公司檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件的單因素方差進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，閾值P設(shè)為0.05。相關(guān)性利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 硒缺乏對(duì)泌乳奶?？寡趸δ艿挠绊?/p>

表1 試驗(yàn)?zāi)膛？寡趸癄顩rTable 1 Antioxidant condition of the experimental dairy cattle

2.2 血漿硒與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析

如表2所示，通過Pearson相關(guān)性分析硒與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析，其中GSH-Px和MDA水平與缺硒相關(guān)性最大。

表2 血漿中硒與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性Table 2 Correlation between selenium and antioxidant index

2.3 硒缺乏對(duì)泌乳奶牛免疫功能的影響

由表3可見，缺硒組奶牛血液IL-1β、TNF-α、 IgG、IL-6水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ寮?xì)胞因子的水平Table 3 Cytokines index of the experimental dairy cattle serum

2.4 血漿硒與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析表明（表4），血漿中IL-1β（R=0.24，P=0.20）與硒水平有相關(guān)性但差異不顯著，IL-6（R=0.35*，P=0.03）、IgG（R=0.39*，P=0.02）、IL-2（R=0.38*，P=0.03）、TNF-α（R=0.37*，P=0.02）與硒水平呈顯著正相關(guān)。

表4 奶牛血漿硒與細(xì)胞因子的相關(guān)性Table 4 Correlation between selenium and cytokines of dairy cattle plasma

2.5 硒缺乏對(duì)泌乳奶牛肝功的影響

由表5可見，缺硒組中ALP、TP之間差異均顯著（P＜0.05）。

表5 試驗(yàn)?zāi)膛８喂δ軤顩rTable 5 Liver function status of the experimental dairy cattle

2.6 血漿硒與肝功指標(biāo)的相關(guān)性分析

ALP（R=-0.32*，P=0.03）和TP（R=-0.41*，P= 0.02）與硒水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

表6 奶牛血漿硒與肝功指標(biāo)的相關(guān)性Table 6 Correlation between selenium and liver function index in dairy cattle plasma

3 分析與討論

3.1 硒缺乏對(duì)泌乳奶?？寡趸δ艿挠绊?/p>

硒是動(dòng)物體細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的組成部分。硒是GSH-Px的主要成分，GSH-Px能清除體內(nèi)多余的自由基，同時(shí)也可以作為脂質(zhì)抗氧化的調(diào)節(jié)者，其檢測范圍在45.53-88.52 U·mL-1[1]。SOD的主要作用是清除體內(nèi)自由基，保護(hù)脫氫酶免受超氧自由基影響失活，其正常的生理范圍在46.13±5.58 U·mL-1。MDA是反映機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，可以通過測定其含量了解膜脂過氧化的程度，其檢測范圍在1.96～ 3.31 nmol·mL-1[2]。T-AOC是衡量動(dòng)物機(jī)體抗氧化功能的綜合指標(biāo)，可以反映對(duì)外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝狀況，該防御體系的機(jī)能降低會(huì)引起其他疾病的發(fā)生[3]。當(dāng)機(jī)體長時(shí)間缺硒會(huì)導(dǎo)致TNOS表達(dá)水平升高，大量的NO釋放，導(dǎo)致NO代謝改變引發(fā)器官損傷。當(dāng)體內(nèi)H2O2大量生成時(shí)，LPO含量增高，協(xié)同GSH-Px和CAT共同完成細(xì)胞內(nèi)H2O2的分解，LPO的檢測范圍是1.6～5.2 μmol·mL-1。在奶牛飼料中添加硒可以明顯的看到血清中GSH-Px、SOD的活性增加，MDA、LPO的含量下降，機(jī)體自由基水平下降，維持機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)相對(duì)平衡，減少細(xì)胞損傷，表明機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)較好[3]。甘璐研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)硒的大鼠體內(nèi)MDA含量下降，SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC活性增高，表明機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性有效的抑制大鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化[4]。這表明硒能有效的清除體內(nèi)活性氧，減少體內(nèi)過氧化物的產(chǎn)生而保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化物的損害。實(shí)驗(yàn)中健康對(duì)照組與缺硒組相比，健康對(duì)照組血漿中SOD、GSH-Px、活性升高，MDA、LPO、T-NOS活性降低，T-AOC和CAT活性無明顯變化。這表明缺硒會(huì)使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，相比硒正常狀態(tài)時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體健康造成損害。

3.2 血漿硒與抗氧化指標(biāo)的關(guān)系

在正常情況下，奶牛機(jī)體的抗氧化能力和氧化能力（產(chǎn)生自由基）一直處于在一個(gè)相對(duì)平衡狀態(tài)，并且不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。這種穩(wěn)定平衡一旦被打亂，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織氧化損傷，改變機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使機(jī)體極易繼發(fā)多種疾病。

動(dòng)物體都有一套完整的抗氧化系統(tǒng)來防止氧自由基對(duì)生物膜的損傷。按其性質(zhì)可分為酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)，SOD、GSH-Px和T-AOC屬于酶抗氧化系統(tǒng)，Cu、Mn、Zn是酶抗氧化系統(tǒng)的中心元素，但他們屬于非酶抗氧化系統(tǒng)。硒是谷胱甘肽過氧化物酶中起氧化還原催化作用的原子，起關(guān)鍵作用[6]。硒可以促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，并且可以在體外增加γ-干擾素的活性，增強(qiáng)人體自然殺傷（NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，而不損傷靶細(xì)胞膜[7]。硒可以對(duì)抗由叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷，解除動(dòng)物體內(nèi)過氧化物對(duì)機(jī)體的毒害作用[8]。

在實(shí)驗(yàn)中，通過Pearson相關(guān)系數(shù)表明GSH-Px（R=0.36*，P=0.01）與硒水平呈顯著正相關(guān)，MDA（R=-0.36*，P=0.02）、T-NOS（R=-0.30*，P=0.05）、LPO（R=-0.30*，P=0.04）與硒水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這表明當(dāng)奶牛硒缺乏時(shí)，GSH-Px活性發(fā)生改變，清除自由基能力減弱，抗氧化系統(tǒng)發(fā)生變化，導(dǎo)致機(jī)體組織氧化損傷，產(chǎn)生大量的自由基和脂質(zhì)過氧化物，使機(jī)體氧化平衡狀態(tài)被打破。當(dāng)機(jī)體處于硒缺乏狀態(tài)時(shí)，GSH-Px、T-AOC、CAT、SOD水平會(huì)降低，MDA、TNOS、LPO、NO水平會(huì)升高。

3.3 硒缺乏對(duì)泌乳奶牛免疫功能的影響

細(xì)胞免疫應(yīng)答可以特異性殺傷抗原同時(shí)對(duì)體液免疫也起到促進(jìn)的作用，細(xì)胞免疫正常情況下是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)參與的特異性防御反應(yīng)。IL-2是T細(xì)胞發(fā)育過程中重要的生長因子，由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生作用于T淋巴細(xì)胞表面的IL-2受體，進(jìn)一步刺激T細(xì)胞的分泌增殖。動(dòng)物體內(nèi)IgG主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，有抗病毒和抗菌等免疫活性作用。尚遠(yuǎn)宏等研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)硒可以使小鼠血清中IL-2和干擾素水平顯著增加[9]。硒可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-1和IL-2，提高機(jī)體合成IgG能力，抗體水平明顯提高。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組IL-2和IgG水平比缺硒組高，表明硒可以干擾免疫活性細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，提示缺硒使得機(jī)體的免疫能力下降，引起免疫功能的抑制。

IL-1β具有免疫調(diào)節(jié)功能，是單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和多肽調(diào)節(jié)因子。研究表明當(dāng)硒缺乏時(shí)，雛雞血清IL-1β含量下降，免疫器官（脾臟）受到損傷導(dǎo)致機(jī)體防御機(jī)能下降[10]。Safir報(bào)道了畜禽通過補(bǔ)硒可以提高巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-1和TNF-α的能力[11]。實(shí)驗(yàn)同樣的證實(shí)了健康對(duì)照組IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯的高于缺硒組。

3.4 血漿硒與免疫功能指標(biāo)的關(guān)系

硒通過GSH-Px對(duì)特異性和非特異性免疫起到抗氧化作用。機(jī)體硒缺乏時(shí)，T、B淋巴細(xì)胞受到抑制。補(bǔ)硒可以增加機(jī)體免疫功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分裂增殖。IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子。能使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并且通過和集落刺激因子協(xié)同來增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能[12]。

在實(shí)驗(yàn)中，IgG（R=0.39*，P=0.02）、IL-2（R= 0.38*，P=0.03）、IL-6（R=0.35*，P=0.03）、TNF-α（R= 0.37*，P=0.02）與硒水平顯著正相關(guān)，這表明缺硒會(huì)對(duì)免疫功能有影響。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)，成熟淋巴細(xì)胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發(fā)揮其免疫功能。當(dāng)機(jī)體處于硒缺乏狀態(tài)時(shí)，IgG、IL-2、IL-6、TNF-α水平降低。

3.5 硒缺乏對(duì)泌乳奶牛肝功的影響

評(píng)價(jià)奶牛肝功能的指標(biāo)通常是觀測TP、ALB和GLB三項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)它們也是檢測奶牛蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況的標(biāo)志[13]。ALB的濃度伴隨著日糧蛋白質(zhì)的變化而變化，當(dāng)ALB濃度下降表明機(jī)體缺乏蛋白質(zhì)，也會(huì)導(dǎo)致肝臟白蛋白合成降低。白蛋白和球蛋白通過相互補(bǔ)償來維持總蛋白的恒定水平[14]。泌乳奶牛血液TP的正常范圍在62～82 g·L-1，ALB的正常范圍是28～39 g·L-1，GLB是34～53 g·L-1，ALP的檢測范圍是8.9～121U·L-1，A/G的正常范圍值小于1[15]。ALP在臨床上用于肝膽疾病的診斷，其廣泛分布于人體肝臟、腸、腎、胎盤和骨骼等組織，它們都會(huì)經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶，臨床上用于肝膽疾病的診斷。TP作為營養(yǎng)物質(zhì)的載體參與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，它的濃度變化都在正常范圍內(nèi)。機(jī)體在正常情況下，ALP會(huì)受到細(xì)胞膜的屏障作用，不會(huì)在血液中出現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體自由基大量聚集時(shí)，細(xì)胞膜的通透性會(huì)升高，使ALP釋放到血液中的速度加快，會(huì)增加ALP在血漿中的濃度。TP在血液中濃度過高，表明肝臟儲(chǔ)存能力較低，不利用細(xì)胞的修復(fù)。在實(shí)驗(yàn)中，盡管兩組中ALP和TP差異顯著，但是全部指標(biāo)均處于正常范圍內(nèi)，這表明微量缺硒并未對(duì)肝功造成明顯的損害并且表明硒含量多可以刺激抗體的產(chǎn)生，提高機(jī)體抗病能力的同時(shí)也提高機(jī)體修復(fù)和愈合能力[16]。但不排除嚴(yán)重缺硒會(huì)對(duì)泌乳奶牛肝臟產(chǎn)生影響。

3.6 血漿硒與肝功指標(biāo)的關(guān)系

TP、ALB和GLB通常是評(píng)價(jià)奶牛肝功能的指標(biāo)，也是反應(yīng)機(jī)體肝臟健康狀況的指標(biāo)，同時(shí)也能反應(yīng)外界免疫能力的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)中，通過Pearson相關(guān)系數(shù)表明，動(dòng)物體硒水平與ALB、ALP、TP、GLB、A/G全部呈負(fù)相關(guān)。其中ALP（R=-0.32*，P=0.03）和TP（R=-0.41*，P=0.02）與硒水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這表明缺硒會(huì)對(duì)肝臟有影響，降低機(jī)體的抗病能力，但是在正常的范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)肝臟照成損傷。有文獻(xiàn)表明人類適當(dāng)補(bǔ)硒對(duì)人類肝臟具有保護(hù)作用，患肝病的人普遍體內(nèi)都存在缺硒現(xiàn)象[17-18]。當(dāng)機(jī)體處于硒缺乏的狀態(tài)時(shí)，ALP、TP水平會(huì)增高。

4 結(jié)論

缺硒奶牛易處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時(shí)缺硒對(duì)免疫功能和肝功也造成了顯著的影響，故對(duì)牛群硒水平的檢測評(píng)估對(duì)及早預(yù)防疾病的發(fā)生以及改善飼養(yǎng)管理水平尤為重要。

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Study of Blood Clinical Pathological Changes of Selenium Deficiency of Dairy Cattle in Intensive Dairy Farm

Cao Yu1，Li Lan2，Zhang Hongyou1
（Collge of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

30 dairy cattle（selenium group）and 20 dairy cattle（healthy control group）were selected from two intensive dairy farms（A，B）and analyzed their anti-oxidation ability，immune function and liver function.The results showed that compared with the control group，plasma selenium significantly reduced GSH-Px activity，and selenium levels were significantly correlated，MDA，T-NOS and LPO levels significantly increased，MDA，T-NOS，LPO and selenium levels were significantly negatively correlated；Plasma IL-1β，IgG，TNF-α and IL-6 levels in selenium group were significantly reduced（P＜0.05），TNF-α，IL-6，IgG，IL-2 and selenium levels were significantly correlated.Selenium deficiency in plasma ALP，TP levels were significantly increased，ALP，TP and selenium levels were significantly negatively correlated.It showed that selenium deficiency disease affected antioxidant capacity and immune function of the lactating cattle.

dairy cattle；Selenium deficiency；antioxidant；immune function；liver function

S858.23

A

1002-2090（2016）06-0049-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.010

2015-11-20

東北農(nóng)區(qū)奶牛規(guī)模化健康養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)集成與產(chǎn)業(yè)化示范（2012BAD12B05）。

曹宇（1991-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

張洪友，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhy478@163.com。