巴寅穎 于 萍 杜宇瓊 車念聰 靳 華 吳 霞

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實驗室,北京,100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬佑安醫(yī)院,北京,100069)

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HPLC法測定芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素的含量

巴寅穎1于 萍1杜宇瓊1車念聰1靳 華2吳 霞1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實驗室,北京,100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬佑安醫(yī)院,北京,100069)

目的:建立高效液相色譜法測定芪紅水煎劑中2種主要有效成分花旗松素和槲皮素的含量。方法:采用Waters Sunfire C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相梯度洗脫,流速1 mL/min,檢測波長290 nm(花旗松素)、365 nm(槲皮素)。結(jié)果:花旗松素和槲皮素線性范圍分別為0.075 5～0.120 8 μg(r=0.999 4)和0.030 8～0.092 4 μg(r=0.999 9);平均加樣回收率(n=6)分別為102.74%(RSD=1.71%)和102.45%(RSD=1.52%)。結(jié)論:本法簡便、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素的含量測定。亦可作為芪紅水煎液質(zhì)量控制方法之一。

芪紅水煎劑;水紅花子;黃芪;花旗松素;槲皮素

芪紅水煎劑是“全國名老中醫(yī)藥專家錢英教授傳承工作室”和中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實驗室基于肝纖維化絡(luò)病“虛”“瘀”并存的基本病機(jī)及結(jié)合國家級名老中醫(yī)藥專家錢英教授多年的臨床經(jīng)驗總結(jié),選用水紅花子:黃芪=1∶4相配伍制成的用于治療肝纖維化的中藥方劑[1-2]。此配伍與中醫(yī)學(xué)對肝纖維化氣虛血瘀、正虛邪戀的病機(jī)認(rèn)識相一致。文獻(xiàn)調(diào)研和前期的藥理研究表明,水紅花子、黃芪及芪紅水煎劑對免疫肝纖維化大鼠的肝組織纖維化程度有明顯改善作用[3-8]。為保證藥物質(zhì)量可控,芪紅水煎劑亟待建立穩(wěn)定、可靠的質(zhì)量控制方法。水紅花子為蓼科植物紅蓼(PolygonumorientaleL.)的成熟果實。味辛、咸,性微寒。歸肝、脾、胃經(jīng)。具有散血消癓,消積止痛的功效。在臨床上可用于急慢性肝病中的各期的治療。花旗松素和槲皮素是水紅花子的主要有效成分[9-14],花旗松素也是2015版藥典中水紅花子含量測定的指標(biāo)性成分[15]。因此,研究芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素的含量測定方法具有重要意義。本實驗采用HPLC法建立芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素的含量測定方法,為系統(tǒng)建立芪紅水煎液的質(zhì)量控制方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Waters 2695高效液相色譜儀(waters科技有限公司),2998PDA檢測器,Empower工作站,自動進(jìn)樣;Sartorious AG ME2355型1/100000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);HH-S型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)。水紅花子藥材購自北京同仁堂有限公司(批號:091117,產(chǎn)地:遼寧本溪);黃芪購自北京同仁堂有限公司(批號:100918,產(chǎn)地:甘肅渭原)。槲皮素(批號:100081-201408,純度:99.1%)和花旗松素(批號:111816-201102,純度:98.9%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(Fisher公司,色譜純);娃哈哈純凈水;磷酸(北京試劑廠,分析純)。其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液制備 對照品溶液制備:精密稱取花旗松素7.55 mg、槲皮素7.70 mg,分別置于25 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻,作為對照品儲備液。花旗松素對照品儲備液濃度0.302 mg/mL,槲皮素對照品儲備液濃度0.308 mg/mL。供試品溶液制備:稱取水紅花子10.0 g,黃芪40.0 g,置于圓底燒瓶中,加8倍量蒸餾水,回流提取1.5 h,過濾,濾渣繼續(xù)加6倍量蒸餾水,回流提取1 h,過濾。合并濾液,濃縮干燥成干粉,備用。精密稱取芪紅水煎劑樣品粉末約400 mg,置于三角瓶中,精密量取甲醇10 mL,稱重,超聲30 min,放至室溫后再稱重,補(bǔ)足至原重量,0.45 μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。

1.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱:Waters Sunfire C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長290 nm(花旗松素)、365 nm(槲皮素);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。流動相:甲醇(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫:30%～39%甲醇(0—10 min),39%～47%甲醇(10—20 min),47%甲醇(20—30 min),47%～58%甲醇(30—40 min)。依上述色譜條件,分別精密吸取花旗松素和槲皮素對照品溶液各10 μL、供試品溶液20 μL分別進(jìn)樣,進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。

1.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取一定量的花旗松素和槲皮素對照品儲備液,置于10 mL容量瓶中,甲醇定容搖勻,配制成6份不同濃度的混合對照品溶液。6份混合對照品溶液中花旗松素對照品濃度為0.007 55、0.015 1、0.030 2、0.060 4、0.090 6、0.120 8 mg/mL,槲皮素對照品濃度為0.003 08、0.007 7、0.015 4、0.030 8、0.061 6、0.092 4 mg/mL。分別取以上對照品溶液,用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣10 μL,按“2.1”項下色譜條件測定色譜峰峰面積。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并分別進(jìn)行線性回歸。

1.2.4 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,按“2.1”項下色譜條件測定色譜峰峰面積,連續(xù)測定6次,計算花旗松素和槲皮素色譜峰面積RSD。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一芪紅水煎劑樣品溶液,分別于樣品溶液制備后0、2、4、6、8、12、24 h樣,每次進(jìn)樣20 μL,按“2.1”項下色譜條件測定色譜峰峰面積。計算花旗松素和槲皮素色譜峰面積RSD。1.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批芪紅水煎劑樣品粉末6份,每份約400 mg。按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件,分別進(jìn)樣20 μL,記錄花旗松素和槲皮素峰面積。計算芪紅水煎劑樣品中花旗松素和槲皮素的平均含量和RSD。

圖1 芪紅水煎劑樣品與對照品高效液相色譜圖

注：A花旗松素對照品(290 nm);B槲皮素對照品(365 nm);C芪紅水煎劑樣品溶液(290 nm);D芪紅水煎劑樣品溶液(365 nm)。1花旗松素;2槲皮素。

1.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批芪紅水煎劑樣品粉末(花旗松素和槲皮素的平均含量為0.548 mg/g和0.438 mg/g)6份,每份約200 mg,置于三角瓶中,分別加入花旗松素對照品溶液0.35 mL(濃度為0.030 2 mg/mL)、槲皮素對照品溶液0.3 mL(濃度為0.308 mg/mL),精密量取甲醇5 mL,稱重,超聲30 min,放至室溫后再稱重,補(bǔ)足至原重量,0.45 μm微孔濾膜過濾,制成供試品溶液,按“2.1”下色譜條件,進(jìn)樣20 μL,記錄花旗松素和槲皮素峰面積。計算花旗松素和槲皮素的平均回收率和RSD。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 依上述色譜條件,花旗松素的洗脫時間為15.8 min,槲皮素的洗脫時間為39.5 min,在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上,有相同保留時間且有相同紫外吸收的色譜峰,且與其他成分分離良好。結(jié)果見圖1。

2.2 線性關(guān)系考察 花旗松素回歸方程為:Y=34 801 528.75 X+15 909.96,r=0.999 4(n=6);槲皮素回歸方程為:Y=59 529 654.69 X+21387.78,r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明,花旗松素、槲皮素分別在0.075 5～0.120 8 μg和0.030 8～0.092 4 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度考察 花旗松素和槲皮素色譜峰面積RSD分別為0.68%、1.07%。表明該方法精密度良好,符合定量分析要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗 花旗松素和槲皮素色譜峰面積RSD分別為1.71%和1.36%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗 計算得芪紅水煎劑樣品中花旗松素和槲皮素的平均含量分別為0.548 mg/g和0.438 mg/g,RSD分別為1.98%和2.21%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗 計算得花旗松素和槲皮素的平均回收率(n=6)分別為102.74%和102.45%,RSD分別為1.71%和1.52%。具體結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.7 樣品含量測定 按芪紅水煎劑處方比例(水紅花子:黃芪=1∶4)將藥材混合,共50 g,8倍量水回流提取1.5 h,過濾,濾渣繼續(xù)用6倍量水回流1 h,過濾,合并濾液,濃縮干燥成干粉,同時制備3批。精密稱取每批芪紅水煎劑樣品粉末約400 mg,分別置于三角瓶中,精密量取甲醇10 mL,稱重,超聲30 min,放至室溫后再稱重,補(bǔ)足至原重量,0.45 μm微孔濾膜過濾,進(jìn)樣20 μL,按“2.1”項下色譜條件測定色譜峰峰面積。計算花旗松素和槲皮素含量。結(jié)果見表2。

表2 芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素含量(n=3)

3 討論

本試驗首次采用高效液相色譜法測定芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素的含量,所建立的方法簡單、準(zhǔn)確、可靠,可作為芪紅水煎劑質(zhì)量控制方法之一。

為保持與臨床藥理實驗的一致性,本試驗所采用的提取方法與臨床藥理實驗樣品一致。流動相選擇時,曾考察了乙腈-0.5%甲酸水溶液、乙腈-0.5%磷酸水溶液、甲醇-0.5%甲酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液等,結(jié)果用甲醇-0.5%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫分離度較好。

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(2016-05-05收稿 責(zé)任編輯：王明)

Determination of Taxifolin and Quercetin in Qihong Decoction: HPLC Method

Ba Yinying1, Yu Ping1, Du Yuqiong1, Che Niancong1, Jin Hua2, Wu Xia1

(1BeijingKeyLaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2BeijingYouAnHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective:To establish an HPLC method for the determination of taxifolin and quercetin in Qihong decoction.Methods:The determination was carried out with Waters Sunfire C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), using methanol-0.5% phosphoric acid as mobile phase with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min and it was detected that the wave length was 290 nm (taxifolin) and 365 nm (quercetin).Results:The linear ranges of taxifolin and quercetin were 0.0755～0.1208 μg(r=0.9994) and 0.0308～0.0924 μg(r=0.9999); the average recovery rate (n=6) was 102.74% (RSD=1.71%) and 102.45% (RSD=1.52%) respectively.Conclusion:This method was simple, steady and reliable, which could be used to determine the contents of taxifolin and quercetin and to control the quality of Qihong decoction.

Qihong decoction; Fructus polygoni orientalis; Radix astagali; Taxifolin; Quercetin

首都中醫(yī)藥研究專項課題(編號:16ZY07)

巴寅穎(1986.02—),女,博士,講師,研究方向:中藥化學(xué),Tel:(010)83911633,E-mail:byy3333@sina.com

吳霞(1967.10—),女,博士,教授,研究方向:中藥化學(xué),Tel:(010)83911671,E-mail:wuxia6710@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.057