羅云春 易 文 姚宇宙 朱 妮

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院，宜昌，443000)

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潰結(jié)方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清炎性反應(yīng)因子與腸黏膜修復(fù)作用的研究

羅云春 易 文 姚宇宙 朱 妮

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院，宜昌，443000)

目的：觀察潰結(jié)方對潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠炎性反應(yīng)因子及JAK2/STAT3信號通路的影響，并探討其可能的作用機制。方法：采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌腸法建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，每日灌胃給予潰結(jié)方治療，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定UC大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α及抗炎因子IL-10、IL-4的水平，肉眼觀察大鼠結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)改變并進行評分，免疫組織化學(xué)法(SP法)測定結(jié)腸組織中JAK2和STAT3蛋白的表達。結(jié)果：潰結(jié)方可顯著降低UC大鼠血清IL-6、TNF-α水平，同時升高抗炎因子IL-10、IL-4，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；潰結(jié)方可明顯降低UC大鼠結(jié)腸DAI及CMDI評分(P<0.05)，同時潰結(jié)方可減少結(jié)腸組織中JAK2和STAT3蛋白的表達。結(jié)論：潰結(jié)方可調(diào)節(jié)UC大鼠體內(nèi)促炎因子和抗炎因子的平衡，減緩炎性反應(yīng)，改善UC大鼠結(jié)腸潰瘍損傷，可能的機制是與其減少JAK2和STAT3蛋白的表達相關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎；潰結(jié)方；炎性反應(yīng)；JAK2/STAT3信號通路

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是一種累計結(jié)腸和直腸的非特異性炎性反應(yīng)性腸病，其發(fā)病主要與病菌感染、機體免疫系統(tǒng)異常以及遺傳等多種因素相關(guān)。UC發(fā)病病程長，常反復(fù)發(fā)作，治愈難度大，嚴重者可進展為結(jié)腸癌，但相關(guān)機制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)是造成UC和和結(jié)腸損傷的關(guān)鍵因素之一，其中促炎因子和抗炎因子平衡失調(diào)在UC發(fā)病、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮著重要作用[1-2]。目前西醫(yī)對于UC的治療藥物主要是糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸制劑和免疫抑制劑，但因其不良反應(yīng)較多、遠期療效差等仍無法滿足臨床要求，而中藥治療由于其多種優(yōu)勢，在治療UC上越來越受到重視[3-4]。潰結(jié)方由由黃芪、白術(shù)、蒼術(shù)、青黛、白頭翁、敗醬草、紅花7味藥物組成，通過健脾益氣、活血化瘀對UC具有一定治療功效，可明顯緩解UC患者腹痛、腹瀉和便血等癥狀[5]。本研究采用潰結(jié)方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清及結(jié)腸組織中炎性反應(yīng)因子及相關(guān)蛋白表達的影響，探討潰結(jié)方對潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果和可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只，體重(200±20)g，從三峽大學(xué)實驗動物中心購入，動物合格證號：2013-0023。

1.2 藥物 潰結(jié)方各成分均同一批次購于三峽大學(xué)附屬醫(yī)院。柳氮磺吡啶腸溶片(Sulfasalazine，SASP)，上海信誼藥廠生成，批號20131111，120 mg/粒，用蒸餾水配置成濃度為0.15 g/mL懸液。

1.3 試劑與儀器 2.4.6-三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-)α、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)ELISA檢測試劑盒，廣州杰特偉生物科技有限公司；兔抗鼠JAK-2和STAT-3抗體(美國Santa Cruz公司)，羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)，總蛋白提取試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，4%多聚甲醛，低溫高速離心機(美國Beckman)，高速組織勻漿儀(瑞士羅氏)，全自動酶標儀(美國PerkinElmer公司)，Olympus倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)，Olympus顯微拍照系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.4 動物模型建立 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為空白組，模型組，潰結(jié)方組，SASP組，每組各10只，所有大鼠造模前禁食24 h，不禁飲水。造模組大鼠采用乙醚麻醉，將外徑2.0 mm、長約12 cm左右的輸液管(輸液管先用液體石蠟油潤滑)，從大鼠肛門逆行插入結(jié)腸內(nèi)深約4.0 cm處，用長約12 cm左右的輸液管注入相應(yīng)體重比例的造模劑(5%TNBS和無水乙醇按1∶1體積比混合)，然后再注入約0.3 mL的空氣，用棉簽堵住大鼠肛門，輕揉大鼠腹部1 min，以盡可能清除黏附在注射器和灌腸硅膠管壁上的藥液，為確保注入的TNBS能夠在大腸內(nèi)彌散性分布，注入后將大鼠頭向下，身體傾斜60°，放置1 min，造模后小鼠使仰臥，自然清醒，空白組采用同體積滅菌的生理鹽水灌腸。從造模第2天開始灌胃給藥，劑量均按人與大鼠間體表面積折算的等劑量比值表進行換算，潰結(jié)方高劑量組的劑量為3.36 g/kg，潰結(jié)方低劑量組的劑量為1.68 g/kg，SASP組采用柳氮磺吡啶混懸液灌胃，劑量為0.3 g/kg，每次灌胃體積均約為3 mL，1次/d，連續(xù)灌胃21 d。模型組采用相同方式給予生理鹽水。每日觀察小鼠一般狀況及糞便性狀，采用疾病活動指數(shù)(DAI=體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3對大鼠進行評分。

1.5 標本獲得與指標檢測 治療結(jié)束后取血，頸椎錯位法處死大鼠，取大鼠全結(jié)腸，沿腸系膜緣縱向剖開，用經(jīng)4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，將結(jié)腸組織放入固定液中固定，肉眼觀察結(jié)腸標本并進行評分。取結(jié)腸典型病變組織置于福爾馬林液中固定，標本經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片染色，職稱病理切片，置于顯微鏡下觀察并進行圖像分析。血清IL-6、TNF-α、L-4、IL-10水平采用ELISA試劑盒測，操作過程嚴格按ELISA試劑盒說明書進行。結(jié)腸組織中JAK2及STAT3表達情況：取適量結(jié)腸組織用0.9%生理鹽水制成勻漿，粉碎腸黏膜組織中細胞，離心取上清液，采用免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測JAK2和STAT3的表達，以PBS緩沖液代替一抗作為空白對照，以已知陽性標本作為陽性對照。

1.6 Wstern Blot 采用蛋白提取試劑盒提取不同處理組別結(jié)腸組織總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度，配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，以40 μg的上樣量進行上樣，以60 V和100 V恒壓電泳，濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜放入封閉液中室溫封閉1 h。分別加入1∶200稀釋后的兔抗鼠抗體，4 ℃孵育過夜，PVDF膜經(jīng)TBST洗滌3次后，加入1∶2000的羊抗鼠二抗，于室溫下?lián)u床孵育1 h，經(jīng)顯色后進行X線膠片感光、顯影和定影，并利用Quantity One圖像處理軟件進行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 各建模組大鼠在造模后當(dāng)天出現(xiàn)大便松軟、腹瀉、活動進食減少及隱血試驗陽性等現(xiàn)象，部分大鼠可觀察到血便，一周內(nèi)大鼠體重下降明顯，大鼠腸壁明顯增厚，腸外壁發(fā)生黏連，黏膜充血且可觀察到明顯糜爛和潰瘍。肉眼觀察正常對照組大鼠腸黏膜紋理清晰，未見糜爛潰瘍病變；大鼠在灌胃給藥前DAI和CMDI評分顯著高于空白組(P<0.05)，經(jīng)用藥治療后，潰結(jié)方組和SASP組DAI及CMDI評分顯著下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 潰結(jié)方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI評分及CMDI評分的影響

注：與空白組比較#P<0.05，與模型組比較*P<0.05。

表2 潰結(jié)方對大鼠血清炎性反應(yīng)因子的影響

注：與空白組比較#P<0.05，與模型組比較*P<0.05。

2.2 潰結(jié)方對模型大鼠血漿中炎性反應(yīng)因子水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平明顯上升，與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組血清IL-4和IL-10水平顯著低于正常對照組(P<0.05)，經(jīng)潰結(jié)方治療后，大鼠血清IL-6和TNF-α水平顯著下降，IL-4和IL-10水平顯著上升，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 潰結(jié)方對UC大鼠結(jié)腸組織JAK2和STAT3蛋白表達的影響 經(jīng)灌胃給藥治療后，模型組大鼠結(jié)腸組織JAK2水平相比于正常對照組顯著升高(P<0.05)，而潰結(jié)方組和SASP組大鼠結(jié)腸組織中JAK2水平相比于模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組STAT3蛋白表達量顯著高于正常對照組，經(jīng)潰結(jié)方治療后STAT3蛋白表達明顯下降(P<0.05)，且潰結(jié)方組下降程度大于SASP組(P<0.05)。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織JAK2和STAT3蛋白表達的影響

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織JAK2和STAT3蛋白表達電泳圖

注：A、B、C、D、E分別表示正常對照組，模型組，潰結(jié)方組低劑量組，潰結(jié)方組高劑量組和SASP組。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因復(fù)雜的慢性腸道疾病，腸道菌群和免疫功能的紊亂被認為是UC發(fā)生的主要機制。在UC發(fā)病過程中，由于促炎因子和抗炎因子平衡的失調(diào)，可導(dǎo)致多種細胞因子水平的變化，這些細胞因子是UC產(chǎn)生腸道非特異性反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對于研究UC的發(fā)病機制具有重要作用。IL-6和TNF-α是2種常見的促炎性反應(yīng)細胞因子，可對血小板活化因子(PAF)、白三烯(LT)和一氧化氮(NO)的分泌產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，進而使腸黏膜炎性反應(yīng)加劇，引起腸道損傷[6-7]，多項研究表明，IL-6和TNF-α在促進UC腸道黏膜炎性反應(yīng)的擴大中發(fā)揮了重要作用[8]。IL-4和IL-10是2種抗炎因子，可通過對激活的單核細胞、巨噬細胞及其所產(chǎn)生細胞因子和趨化因子的抑制作用，減少多種促炎因子的釋放，從而發(fā)揮抑制和終止炎性反應(yīng)的功能[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10可下調(diào)TH1細胞反應(yīng)各種相關(guān)的細胞因子的轉(zhuǎn)錄，抑制活化的單核細胞和巨噬細胞分泌炎性反應(yīng)因子，同時對脂多糖誘導(dǎo)的單核細胞NF-kB的活化具有抑制作用[11-12]。Scarpa等臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者在發(fā)病早期，其體內(nèi)促炎因子水平顯著上升，且高于抗炎因子水平，經(jīng)藥物治療后，抗炎因子逐漸上升而促炎因子開始下降，最終炎性反應(yīng)消退，病情緩解并痊愈[13]。

中醫(yī)認為UC是基本病機是脾氣虛弱，致病因素是濕熱之邪，而瘀血阻滯則是UC久病不愈的重要原因[14-15]。潰結(jié)方是臨床上使用廣泛的一種重要方劑，方劑組成由清熱解毒(胡黃連、黃柏、蘆根、天花粉、苦參)，健脾益氣(黨參、白術(shù)、茯苓、甘草)，活血化瘀(當(dāng)歸、紅花、丹參)3組藥物，該方劑與UC的病征具有針對性治療效果。本研究結(jié)果顯示潰結(jié)方可有效降低UC大鼠腸黏膜損傷指數(shù)DAI和CMDI，改善大鼠的營養(yǎng)狀況和生命體征，說明潰結(jié)方可有效修復(fù)UC大鼠腸黏膜損傷。經(jīng)潰結(jié)方治療后，UC大鼠血清促炎因子IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.01)，同時抗炎因子IL-10和IL-4水平顯著升高(P<0.01)，說明潰結(jié)方可有效調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，通過抑制促炎因子IL-6和TNF-的α表達及促進抗炎因子IL-10和IL-4的表達，減輕腸道炎性反應(yīng)，進而促進腸潰瘍組織的恢復(fù)。

JAKs家族是一類不同類型的非受體型絡(luò)氨酸蛋白激酶。JAK2作為JAKs家族的重要成員之一，其結(jié)構(gòu)與JAKs家族具有高度的同源性，且在體內(nèi)廣泛分布，多存在與體細胞的胞質(zhì)中。JAK2可與STAT家族多個成員(如STAT3、STAT5)構(gòu)成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過這些信號通路，JAK2可直接或間接參與多種細胞的生命過程，并與某些炎性反應(yīng)的發(fā)生具有密切相關(guān)性[16]。有研究表明，JAK2可影響IL-6介導(dǎo)的腎小管上皮細胞分化過程，而JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過調(diào)節(jié)細胞的黏附作用，對腎上皮細胞的增殖具有誘導(dǎo)作用，進而促進腎細胞的纖維化[17]。本研究結(jié)果顯示，UC大鼠腸黏膜中JAK2蛋白的表達量顯著上調(diào)，經(jīng)潰結(jié)方藥物治療后，JAK2表達均有不同程度下降，其中高劑量組和SASP組下降最為顯著。這提示了JAK2可能參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生過程，且JAK2的表達水平可能與疾病的嚴重程度相關(guān)，而潰結(jié)方可有效地抑制腸黏膜上JAK2蛋白的表達，這提示了其可能是通過對JAK2/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用，來發(fā)揮抗炎的目的。

STAT3是一種廣泛參與機體免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)的信號分子，同時也參與細胞的增殖和凋亡等過程。臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸黏膜中STAT3蛋白表達水平上升，且其表達主要集中在炎性反應(yīng)區(qū)域，在正常黏膜組織中表達量并未顯著上升，表明STAT3參與了潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜的炎性反應(yīng)[18]。近年來研究表明，在潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌中，均能發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路的激活，而IL-6、EGF和瘦素是激活STAT3的細胞因子[19]。Piodi等通過給予大鼠JAK和STAT特異性抑制劑，觀察大鼠腸黏膜炎性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)JAK/STAT抑制劑可有效阻斷JAK/STAT信號通路并緩解大鼠結(jié)腸炎[20]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠STAT3表達顯著高于其他各組，經(jīng)藥物灌胃治療后，潰結(jié)方組和SASP組STAT3表達均下降，其中潰結(jié)方組下降程度最為顯著，這提示了潰結(jié)方可能通過作用與JAK2/STAT3信號通路來發(fā)揮抗炎效果。

綜上所述，潰結(jié)方可通過下調(diào)UC小鼠JAK2及STAT3的水平，抑制相關(guān)信號通路活性的表達，調(diào)節(jié)促因子IL-6、TNF-和α抗炎因子IL-10、IL-4之間的平衡，減輕炎性反應(yīng)的發(fā)生，進而促進腸黏膜組織修復(fù)，從整體上改善潰瘍性結(jié)腸炎消化吸收障礙和免疫機制紊亂等癥狀，為探討潰瘍性結(jié)腸炎的中西醫(yī)結(jié)合治療的機制提供一定理論基礎(chǔ)。

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(2016-03-15收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effects of Kuijie Formula on Expression of Inflammatory Factors and Repair Intestinal Mucosa on Rat Blood Serum

Luo Yunchun，Yi Wen，Yao Yuzhou，Zhu Ni

(TheFirstCollegeofClinicalMedicalScience，ChinaThreeGorgesUniversity/YichangCenterPeople′sHospital，Yichang443000,China)

Objective:To observe the effects of Kuijie Formula on the expression of inflammatory factors and JAK2，STAT3 in ulcerative colitis rats and to explore its mechanism.Methods:TNBS solution was used to build the ulcerative colitis rats models and Kuijie Formula was administrated by gavage everyday.Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA)method was used to test UC rat′s TNF-α，IL-6，IL-10，IL-4； the pathological changes of the colon in rats was observed by naked eyes.JAK2 and STAT3 were determined by immunohistochemical staining(SP method).Results:Kuijie Formula can reduce the TNF-α，IL-6 levels and level up the IL-10，IL-4 in serum significantly(P<0.05).It can also reduce the DAI and CMDI sores of the rats′ colon as well as the expression of JAK2 and STAT3 in colon tissues.Conclusion:Kuijie Formula can regulate the balance of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in UC rats，slow down the inflammatory response and improve the colonic ulcer damage in UC rats.Its mechanism may be related to reducing the inflammatory response and the expression of JAK2 and STAT3.

Ulcerative colitis； Kuijie Formula； Inflammatory response； JAK2/STAT3 signal pathway

湖北省中西醫(yī)結(jié)合科研項目(編號：2013Z-Y16)

羅云春(1980.12—)，男，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤機制研究，E-mail：cuckoo7366@163.com

易文(1970.07—)，男，碩士研究生，主任醫(yī)師，肛腸科主任，研究方向：中醫(yī)胃腸病，E-mail：68313786@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.045