郭爾楚 黃金蘭 陳 奔 郭茜茜 馮曉桃 鐘振國(guó)

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心，南寧，530001； 2 徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，徐州，221004； 3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧，530001)

?

腎虛血瘀證樹(shù)鼩動(dòng)物模型構(gòu)建初探

郭爾楚1黃金蘭2陳 奔1郭茜茜1馮曉桃3鐘振國(guó)1

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心，南寧，530001； 2 徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，徐州，221004； 3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧，530001)

目的：探索腎虛血瘀證樹(shù)鼩動(dòng)物模型的制做方法。方法：將樹(shù)鼩隨機(jī)分為對(duì)照組、模型1組(腹腔注射氫化可的松結(jié)合腎上腺素)和模型2組(腹腔注射氫化可的松結(jié)合角叉菜膠)，5只/組，通過(guò)觀察樹(shù)鼩表征、臟器指數(shù)、血液流變學(xué)、下丘腦-垂體-靶腺軸(甲狀腺軸、性腺軸)激素水平的變化情況評(píng)判腎虛血瘀證模型是否建立。結(jié)果：造模后動(dòng)物均出現(xiàn)“耗竭”現(xiàn)象，腎、前列腺、脾、睪丸不同程度腫大，模型2組甲狀腺萎縮；模型1組血清中雌二醇(E2)和睪酮(T)水平及模型2組中甲狀腺激素(FT3、FT4)、E2水平顯著下降；血液流變學(xué)結(jié)果顯示模型2組血液黏度和紅細(xì)胞壓積增高，而模型1組無(wú)顯著變化。結(jié)論：腹腔注射氫化可的松與腎上腺素的方法能夠較好地模擬腎虛血瘀證樹(shù)鼩動(dòng)物模型。

腎虛血瘀；樹(shù)鼩；動(dòng)物模型

樹(shù)鼩(學(xué)名：Tupaia belangeri，tree shrew)，樹(shù)鼩科樹(shù)鼩屬的動(dòng)物，分布在東南亞各國(guó)。樹(shù)鼩是一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于其解剖特征近似于人類(lèi)，已成功建立了多種人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型，并在病毒學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)和社會(huì)心理學(xué)等方面有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用和研究[1-2]。腎虛血瘀是目前中醫(yī)較為常見(jiàn)的證候，腎虛導(dǎo)致血瘀，血瘀所致腎虛，即腎虛與血瘀并見(jiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，腎虛血瘀與糖尿病[3]、冠心病[4]、高血壓[5]、慢性炎性反應(yīng)[6]等的發(fā)病有明顯關(guān)系，是各種慢性疾病某一特定階段的共同病理變化和致病原因。目前，對(duì)于腎虛血瘀證動(dòng)物模型的較多是由多個(gè)中醫(yī)證候或病證結(jié)合引起的研究。因此，建立穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)的腎虛血瘀證動(dòng)物模型，能夠?yàn)橄嚓P(guān)疾病治療藥物的研發(fā)提供強(qiáng)有力載體。研究表明，樹(shù)鼩因其許多分子與細(xì)胞結(jié)構(gòu)近似人類(lèi)，具有與人相似的腦神經(jīng)和視覺(jué)神經(jīng)，目前已成功用于多種人類(lèi)病毒感染的動(dòng)物模型的建立，而利用樹(shù)鼩構(gòu)建腎虛血瘀證動(dòng)物模型尚未有探索，我們以樹(shù)鼩為研究對(duì)象，初步探索建立腎虛血瘀證動(dòng)物模型的方法，為各種慢性疾病的科研研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10～12個(gè)月齡中緬樹(shù)鼩滇西亞種，雄性，體重120～140 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滇)K2013-0002)。1.2 主要試劑與儀器 鹽酸腎上腺素注射液(遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國(guó))有限公司，批號(hào)：131204)；氫化可的松注射液(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，批號(hào)：1312071)；角叉菜膠(Sigma公司，批號(hào)：CAS9000-07-1)；水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠(chǎng)，批號(hào)：20130513)。化學(xué)發(fā)光儀(UniCel DxI，型號(hào)800)；血流變快測(cè)儀(重慶維多科技有限公司，F(xiàn)ASCO系列-2050A)。

1.3 分組與造模 將樹(shù)鼩隨機(jī)分對(duì)照組、腎虛血瘀證樹(shù)鼩動(dòng)物模型1組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)模型1組)和腎虛血瘀證樹(shù)鼩動(dòng)物模型2組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)模型2組)，5只/組。模型1、2組在第1～3天每天腹腔注射氫化可的松(1 mg/100 g)；第4～5天繼續(xù)腹腔注射氫化可的松(1.5 mg/100 g)；第6～8天，模型1組每天腹腔注射腎上腺素(1 mg/100 g)，模型2組每天腹腔注射角叉菜膠(7.5 mg/100 g)，對(duì)照組每天注射等量的生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 樹(shù)鼩表征變化 包括樹(shù)鼩行為、體征觀察及體重變化。

1.4.2 樹(shù)鼩血液流變學(xué)變化 第7天，腹主動(dòng)脈抽血，血液流變儀檢測(cè)各組動(dòng)物全血黏度、還原黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應(yīng)力以及纖維蛋白原的變化。

1.4.3 樹(shù)鼩下丘腦-垂體-靶腺軸(甲狀腺軸、性腺軸)變化 血液流變學(xué)檢測(cè)后，將血液以3 000 r/min速度離心5 min，取上清液，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定檢測(cè)各組動(dòng)物血液三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、雌二醇(E2)、睪酮(T)的含量。

1.4.4 樹(shù)鼩臟器指數(shù)比較 動(dòng)物稱(chēng)重、取血后，稱(chēng)取各組動(dòng)物腎、前列腺、脾、甲狀腺、睪丸重量，按公式[臟器指數(shù)=臟器濕重(g)/樹(shù)鼩體重(100 g)]計(jì)算其相關(guān)指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)鼩行為、表征觀察及體重變化 對(duì)照組樹(shù)鼩反應(yīng)靈敏、喜動(dòng)、動(dòng)作靈活、皮毛光澤，大便正常。模型1組和模型2組樹(shù)鼩均出現(xiàn)明顯的精神萎靡、倦怠、身體蜷縮、豎毛、少動(dòng)、喜臥、皮毛蓬亂無(wú)光澤，大便干結(jié)癥狀。體重增加，模型1組樹(shù)鼩體重變化明顯高于對(duì)照組[(123.25±4.99)g，(109.60±6.58)g，P=0.024]，模型2組樹(shù)鼩體重變化與對(duì)照組相似[(111.20±10.20)g，(109.60±6.58)g，P=0.751]。

2.2 血液流變學(xué)變化

2.2.1 不同切變率狀態(tài)下血液黏度的比較 與對(duì)照組比較，模型1組和模型2組樹(shù)鼩還原黏度和全血黏度在不同切變率狀態(tài)下均有不同程度升高，其中模型1組樹(shù)鼩還原高切(100/s)黏度和全血黏度(100/s、40/s、10/s)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2.2 血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應(yīng)力級(jí)纖維蛋白原的比較 由表2可知，與對(duì)照組比較，模型1組和模型2組的血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應(yīng)力及纖維蛋白原均有不同程度升高，其中模型1組的各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同切變率狀態(tài)下還原黏度、全血黏度比較

注:與對(duì)照組比較*P<0.05。

表2 各組血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、還原黏度、卡松黏度、卡松屈服應(yīng)力及纖維蛋白原的比較

注:與對(duì)照組比較*P<0.05。

表3 各組樹(shù)鼩臟器指數(shù)的比較

注:與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2.3 臟器指數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型1組和模型2組的腎指數(shù)、脾指數(shù)、前列腺指數(shù)和睪丸指數(shù)數(shù)值均升高，其中模型2組的腎指數(shù)、模型1組與模型2組的前列腺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，而模型1組和模型2組的甲狀腺指數(shù)數(shù)值偏低，數(shù)模型2組降低顯著(P<0.05)。

2.2.4 血清中FT3、FT4、E2、T的比較 與對(duì)照組比較，模型1組的FT3、E2和T及模型2組的FT3、FT4、E2均有所下降，其中模型1組的E2、T水平，模型2組中的FT3、FT4、E2的變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組樹(shù)鼩血清中FT3、FT4、E2、T的變化

注:與對(duì)照組比較*P<0.05。

3 討論

腎上腺皮質(zhì)激素法是最早用于制造腎虛動(dòng)物模型的方法[7]，通過(guò)大劑量外源性皮質(zhì)激素早期能使機(jī)體呈煩躁等腎陰虛表現(xiàn)，但由于腎上腺皮質(zhì)激素可使促腎上腺皮質(zhì)激素釋放受抑制，而使類(lèi)固醇激素分泌減少，所以出現(xiàn)一系列如體溫下降、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、畏寒、體毛稀疏無(wú)光澤等一系列“耗竭”現(xiàn)象，即出現(xiàn)“陰損及陽(yáng)”的轉(zhuǎn)變。根據(jù)《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[8]中對(duì)虛證動(dòng)物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)，我們觀察到模型1組和模型2組樹(shù)鼩精神萎靡、倦怠、身體蜷縮、豎毛、少動(dòng)、喜臥、皮毛蓬亂無(wú)光澤，大便干結(jié)癥狀及體重增加癥狀，因此，本實(shí)驗(yàn)由氫化可的松誘導(dǎo)的腎虛證模型是符合要求的。

中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，腎虛與下丘腦-垂體-靶腺軸(腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸)的紊亂[9]、免疫功能下降有關(guān)。藥物干預(yù)后，我們比較了對(duì)照組、模型組樹(shù)鼩腎臟、脾、甲狀腺、前列腺和睪丸的重量，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，模型1組和模型2組的腎指數(shù)、脾指數(shù)、前列腺指數(shù)和睪丸指數(shù)數(shù)值均有不同程度的升高，說(shuō)明模型動(dòng)物的腎臟、脾、甲狀腺、前列腺和睪丸均有不同程度的腫大，而模型1組和模型2組的甲狀腺指數(shù)數(shù)值偏低，數(shù)模型2組降低顯著(P<0.05)，提示模型2組的甲狀腺有一定的萎縮現(xiàn)象。針對(duì)激素水平的變化，我們主要對(duì)下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定。數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組比較，模型1組的FT3水平有下降趨勢(shì)，模型2組FT3和FT4的變化下降明顯(P<0.05)。模型1組雌二醇和睪酮水平均明顯下降(P<0.05)，模型2組中的雌二醇水平均明顯下降(P<0.05)，但睪酮水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，從甲狀腺功能和生殖系統(tǒng)功能指標(biāo)上評(píng)判，模型1組和模型2組在一定程度上均符合腎虛模型的要求。

李積敏在《腎虛血瘀論》認(rèn)為久病則虛，虛則氣血運(yùn)行不暢，氣血運(yùn)行不暢則易產(chǎn)生瘀滯。瘀滯形成，則阻礙機(jī)體氣血生新不順，則機(jī)體虛弱更甚?？梢?jiàn)腎虛與血瘀是相輔相成的。本研究過(guò)量使用氫化可的松制成腎陽(yáng)虛模型的基礎(chǔ)上分別加用腎上腺素[10]和角叉菜膠[11]建立血瘀模型，血液流變學(xué)考證血瘀模型的建立與否。在血液流變學(xué)檢測(cè)中，全血黏度是反映血液流變學(xué)特性的直觀指標(biāo)，而影響全血黏度的因素有紅細(xì)胞壓積、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集性、紅細(xì)胞變形性、血小板的凝聚性和黏附性等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除了中、低切還原黏度外，模型1組樹(shù)鼩的血液流變學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較，均明顯升高(P<0.05)，提示模型1組樹(shù)鼩的血液黏度和紅細(xì)胞壓積增高，變形性降低等血流緩慢、循環(huán)障礙特點(diǎn)，血液呈現(xiàn)濃、黏、聚、凝的狀態(tài)，符合中醫(yī)血瘀證血液流變學(xué)之共性，而模型2組各項(xiàng)血液流變學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較均無(wú)差異。由此可知，模型1組造模方法能較好初步建立血瘀證樹(shù)鼩模型。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型1組表現(xiàn)出良好的腎虛和血瘀征象，證實(shí)腹腔注射氫化可的松結(jié)合皮下注射腎上腺素的方法可較好地模擬腎虛血瘀證樹(shù)鼩動(dòng)物模型。

[1]彭燕章，葉智彰，鄒如金，等.樹(shù)鼩生物學(xué)[M].昆明:云南科技出版，1991:1-4.

[2]徐新平，陳紅波，賁昆龍.樹(shù)鼩在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中的應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005,13(3):187-191.

[3]王靜.糖尿病腎虛證與血瘀證的相關(guān)性研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[4]季向東，姜俊香，姜延，等.參烏冠心顆粒治療冠心病心絞痛腎虛血瘀證60例臨床觀察[J].廣州中醫(yī)院大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，9(25)：391-394.

[5]馬民.老年男性高血壓病與中醫(yī)腎虛血瘀證相關(guān)性研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2004，24(6)：511-512.

[6]盧敏，張波，鄒震，等.藤黃健骨片治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎腎虛血瘀證的多中心臨床觀察[J].中國(guó)中醫(yī)院骨傷科雜志，2012,20(7):14-16.

[7]鄺安壟.某些助陽(yáng)藥對(duì)于大劑量皮質(zhì)素所致耗竭現(xiàn)象的影響[J].中華內(nèi)科雜志,1963(2)：113-119.

[8]沈自尹.中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986(10):598.

[9]沈自尹，王文健，陳響，等.中腎陽(yáng)虛證的下丘腦-垂體-甲狀腺、性腺、腎上腺皮質(zhì)軸功能的對(duì)比觀察[J].醫(yī)學(xué)研究通訊，1983(10):21-22.

[10]趙玲,魏海峰，李雅莉,等.從血液流變學(xué)的改變分析腎上腺素致血瘀證大鼠模型的建立[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2010，8(2):188-190.

[11]張俊林,劉旭海,孫萍.不同種類(lèi)角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠血栓模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,25(2):68-69.

(2016-10-17收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Study on Tree Shrews Model of Kidney Deficiency and Blood Stasis

Guo Erchu1, Huang Jinlan2, Chen Ben1, Guo Xixi1, Feng Xiaotiao3, Zhong Zhenguo1

(1CenterofResearch&DevelopmentofNewDrugs,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China; 2DepartmentofPharmacology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China; 3Scienceexperimentcenter,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China)

Objective:To explore the way to establish the kidney and blood stasis model in tree shrew. Methods: Tree shrews were randomly divided into 3 groups: normal group, model group 1 (injection of Hydrocortisone and Adrenaline) and model group 2 (injection of Hydrocortisone and Carrageenan). The kidney deficiency and blood stasis model was evaluated by observation of representation of tree shrews, detecting visceral index, hemorheology parameters and the level of hypothalamus-pituitary-target gland axis (thyroid axis, gonad axis). Results: The animal been treated all appeared “exhausted” phenomenon, the kidney, prostate, spleen, testis of the model groups were swelling, but the thyroid in model group 2 was atrophied. The levels of E2 and T in model group 1, levels of FT3、FT4 and E2 in model group 2 declined remarkably. The results of hemorheology showed that the blood viscosity and hematocrit increased in model group 1. Conclusion: The tree shrews model of kidney deficiency and blood stagnation can be established by injection of hydrocortisone and adrenaline.

Kidney deficiency and blood stasis; Tree shrew; Model

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：桂科攻1347003-1)

郭爾楚，男，助教，碩士學(xué)位，研究方向：新藥研究與開(kāi)發(fā)，E-mail：1050457662@qq.com

鐘振國(guó)，男，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：新藥研究與開(kāi)發(fā)，單位：廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心，地址：廣西南寧市明秀東路179號(hào)廣西中醫(yī)藥大學(xué)，郵編：530001，E-mail：gxtcmuzzg@163.com

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.003