曹麗君，程正軍，李 田，蔣曉慧

(西華師范大學(xué) a.化學(xué)化工學(xué)院;b.四川省化學(xué)合成與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

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基于光譜法的酸性紅92結(jié)合牛血清白蛋白的研究

曹麗君，程正軍，李 田，蔣曉慧

(西華師范大學(xué) a.化學(xué)化工學(xué)院;b.四川省化學(xué)合成與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

通過(guò)熒光光譜、紫外-可見(jiàn)光譜(UV-vis)及傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)研究牛血清白蛋白(BSA)與酸性紅92(AR92)之間的相互作用。研究表明AR92對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。位點(diǎn)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明AR92結(jié)合于BSA上的位點(diǎn)Ⅰ(子域ⅡA)。 熱力學(xué)參數(shù)△G0<0，△H0<0，△S0>0暗示BSA與AR92間結(jié)合是以靜電力為主要驅(qū)動(dòng)力的自發(fā)放熱過(guò)程。而且，還探討不同鹽濃度和乙醇對(duì)其結(jié)合作用的影響。此外，分析AR92誘導(dǎo)BSA的構(gòu)象變化。

光譜法；牛血清白蛋白；酸性紅92；熒光猝滅；構(gòu)象變化

酸性紅92(AR92，圖1)是一種人造呫噸著色劑，它已被用在食品、藥物和化妝品等領(lǐng)域[1]。 Qi等[2]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的AR92會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和引發(fā)炎癥反應(yīng)。 因此，研究AR92與蛋白質(zhì)的相互作用具有重要意義。 血清白蛋白(SA)是循環(huán)系統(tǒng)中的主要可溶性蛋白成分，作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物、脂肪酸和末端氨基樹(shù)枝狀聚合物等多種物質(zhì)[3]。 由于牛血清白蛋白(BSA)易于純化和成本低，并且它與人血清白蛋白(HSA)有76%的相似性，因此，BSA已被廣泛用作一個(gè)模型來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)與有機(jī)小分子間的相互作用[4]。近年來(lái)，關(guān)于有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究已成為化學(xué)生物界研究熱點(diǎn)之一。 然而，AR92與BSA結(jié)合特性尚不明確。 故本文運(yùn)用多光譜法探討B(tài)SA和AR92間相互作用，該研究可能為AR92作為食品著色劑等方面提供有用信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

牛血清白蛋白(BSA，純度98%，Mr=68000)購(gòu)自Ruibio公司，使用時(shí)未純化。 BSA溶液用0.05 M磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)配制。 AR92購(gòu)自麥克林生物化學(xué)有限公司(中國(guó)，上海)。 其它化學(xué)品均為分析純。 所有溶液均在4 ℃下儲(chǔ)存，整個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

所有熒光光譜均用配有恒溫槽的Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)，瓦里安)進(jìn)行測(cè)定。 BSA的濃度為2.0 μM，AR92的濃度從0增加到1.94 μM。 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，波長(zhǎng)范圍300～500 nm。 所有熒光滴定實(shí)驗(yàn)均用50 μL手動(dòng)微量注射器完成。

在存在和不存在鹽(0.30、0.60、0.90 M)或乙醇(5%和10%，V/V)的磷酸鹽緩沖液(0.05 M，pH=7.4)中進(jìn)行鹽和乙醇對(duì)BSA與AR92相互作用影響的熒光滴定實(shí)驗(yàn)。

同步熒光光譜激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的間隔Δλ分別為15 nm和60 nm，波長(zhǎng)范圍均為250～350 nm。 其它掃描參數(shù)與以上熒光滴定實(shí)驗(yàn)相同。

采用熒光滴定法研究AR92與BSA結(jié)合的位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，即在3種位點(diǎn)標(biāo)記物保泰松(phenylbutazone，PB)、氟芬那酸(flufenamic，F(xiàn)A) 和洋地黃毒苷(digitoxin,DIG)的存在下探討它們間的相互作用。 BSA和位點(diǎn)標(biāo)記物的濃度均為2.0 μM(pH 7.4)。

所有UV-vis吸收和FT-IR光譜分別通過(guò)UV-3600分光光度計(jì)(日本，島津)和Nicolet-6700 FT-IR光譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 AR92與BSA間相互作用

2.1.1 熒光猝滅機(jī)制

BSA與AR92的結(jié)合熒光猝滅圖譜見(jiàn)圖2(a)。 圖2(a)顯示，BSA的熒光強(qiáng)度隨AR92濃度的增加逐漸下降，且最大發(fā)射波長(zhǎng)有輕微藍(lán)移，表明AR92與BSA發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致BSA中色氨酸殘基周?chē)h(huán)境發(fā)生變化。

AR92與BSA相互作用所產(chǎn)生的內(nèi)濾效應(yīng)不能忽略。 為了消除內(nèi)濾效應(yīng)帶來(lái)的影響，需對(duì)所有熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正，校正系數(shù)η由下式[5]計(jì)算：

(1)

其中，Ax0和Ay0分別表示熒光團(tuán)的吸光度，Axi=Ax0+△Axi和Ayi=Ay0+△Ayi分別是熒光團(tuán)和猝滅劑(△Axi和△Ayi)在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的總吸光度。 校正的Stern-Volmer方程如下：

(2)

式中，測(cè)得熒光比(F0/F)m乘以校正系數(shù)η得到校正的熒光比F0/F；F0和F分別是未加入和加入AR92后BSA的熒光強(qiáng)度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；τ0是不存在AR92時(shí)BSA熒光團(tuán)的平均壽命，通常對(duì)于大多數(shù)熒光蛋白分子τ0為10-8s；[Q]為AR92的濃度。 熒光猝滅通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，動(dòng)態(tài)猝滅或碰撞猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑碰撞引起的熒光猝滅，而基態(tài)熒光分子與猝滅劑結(jié)合形成復(fù)合物猝滅熒光的現(xiàn)象稱為靜態(tài)猝滅。 若F0/F對(duì)[Q]的Stern-Volmer曲線顯示出良好的線性關(guān)系，通常暗示該熒光猝滅為動(dòng)態(tài)或靜態(tài)猝滅。 然而，Stern-Volmer曲線顯示出正偏差(圖2(b))，這表明BSA與AR92的結(jié)合可能是動(dòng)態(tài)和靜態(tài)聯(lián)合猝滅機(jī)制。

若該結(jié)合過(guò)程是一個(gè)聯(lián)合猝滅，那么它們對(duì)應(yīng)的熒光數(shù)據(jù)可用下式分析[6]：

F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])，

(3)

F0/F=1+Kapp[Q]，

(4)

Kapp=[F0/F-1]/[Q]=(KD+KS)+KDKS[Q]，

(5)

其中，Kapp是表觀猝滅常數(shù);KD和KS分別是動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅常數(shù), 它們的值由Kapp對(duì)[Q]線性擬合的 截距和斜率來(lái)計(jì)算。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)BSA-AR92體系的KD和KS值均為虛數(shù)(分別為0.2119+1.4343i和0.2119-1.4343i)，表明該作用過(guò)程不可能是聯(lián)合猝滅機(jī)制。 故該熒光數(shù)據(jù)可以用改進(jìn)的Stern-Volmer等式進(jìn)行處理：

(6)

式中V是靜態(tài)猝滅常數(shù)。 相應(yīng)的參數(shù)列于表1。 從表1可知，BSA-AR92體系的KSV值與溫度呈負(fù)相關(guān)，且它們的Kq值均大于猝滅劑與生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，表明BSA與AR92間相互作用導(dǎo)致的熒光猝滅不是動(dòng)態(tài)猝滅，而是靜態(tài)猝滅[7]。

表1 BSA-AR92體系的Stern-Volmer參數(shù)

注：R和SD分別是S-V曲線的相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.1.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n由下式計(jì)算：

(7)

對(duì)應(yīng)的值列于表2。BSA-AR92體系的結(jié)合常數(shù)K值隨溫度升高而減小，這表明隨溫度的升高，BSA與AR92間結(jié)合作用減弱。 它們間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值近似等于1，表明AR92與BSA間的相互作用存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表2 BSA-AR92體系結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)n和熱力學(xué)參數(shù)

續(xù)表2

注：Ra和Rb分別是K值和Van’tHoff曲線的相關(guān)系數(shù)。

2.1.3 位點(diǎn)標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

為了確定BSA與AR92間的精確綁定位點(diǎn)，我們進(jìn)行位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。BSA是由585個(gè)氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，具有三個(gè)同源α-螺旋結(jié)構(gòu)域(Ⅰ-Ⅲ)，每個(gè)域包含兩個(gè)子域(A和B)。它含兩個(gè)具有固有熒光的色氨酸殘基，即Trp134和Trp212，分別位于子域ⅠB的表面和子域ⅡA的疏水結(jié)合腔。BSA的內(nèi)源性和外源性配體主要結(jié)合于蛋白質(zhì)的子域ⅡA或ⅢA的疏水腔。 許多配位體可以與BSA結(jié)合，如保泰松(phenylbutazone，PB)和華法林(warfarin，WF)結(jié)合于位點(diǎn)Ⅰ，布洛芬(ibuprofen，IP)和氟芬那酸(flufenamic，F(xiàn)A) 結(jié)合于位點(diǎn)Ⅱ，洋地黃毒苷(digitoxin，DIG) 結(jié)合于位點(diǎn)Ⅲ[8]。 本研究采用DIG、FA和PB三種特定部位探針進(jìn)行位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。

它們的熒光數(shù)據(jù)由式(7)進(jìn)行分析，對(duì)應(yīng)的K值列于表3。 顯然，DIG-BSA-AR92和FA-BSA-AR92的K值與BSA-AR92的K值相比幾乎沒(méi)有變化，然而，PB-BSA-AR92的K值遠(yuǎn)小于BSA-AR92的K值。因此，AR92最可能結(jié)合BSA的位點(diǎn)I處，即BSA子域IIA中的Trp-212。

表3 存在和不存在位點(diǎn)標(biāo)記物、不同濃度乙醇時(shí)對(duì)BSA-AR92體系的結(jié)合常數(shù)K

2.1.4 驅(qū)動(dòng)結(jié)合力

熱力學(xué)參數(shù)ΔG0<0、ΔH0<0和ΔS0>0(表2)，表明AR92與BSA主要通過(guò)靜電力結(jié)合[9]，且是放熱自發(fā)反應(yīng)。

2.2 鹽和乙醇對(duì)BSA與AR92結(jié)合作用的影響

2.2.1NaCl的影響

為進(jìn)一步證實(shí)AR92與BSA間通過(guò)靜電力相互作用，我們考察不同濃度NaCl對(duì)BSA-AR92體系的影響。 離子強(qiáng)度的增加容易對(duì)靜電引力產(chǎn)生影響，而不易對(duì)疏水相互作用產(chǎn)生影響[10]。 圖3列出不同濃度鹽存在下BSA校正后的Stern-Volmer圖，相關(guān)參數(shù)列于表1和表2。 結(jié)合常數(shù)隨NaCl濃度增加而顯著減小，表明AR92對(duì)BSA的猝滅程度明顯降低，進(jìn)一步說(shuō)明較高鹽濃度可能減弱HSA對(duì)AR92的吸收進(jìn)而降低其對(duì)人體的危害。 此外，Bolel等[11]發(fā)現(xiàn)，離子強(qiáng)度對(duì)BSA的動(dòng)態(tài)猝滅程度幾乎沒(méi)有任何影響，而對(duì)其靜態(tài)猝滅程度影響顯著。 結(jié)合本研究中鹽對(duì)BSA-AR92體系熒光猝滅的影響可推斷，BSA與AR92的結(jié)合模式不是動(dòng)態(tài)猝滅。

2.2.2 乙醇的影響

乙醇對(duì)外源分子在子域IIA的結(jié)合有影響，從而導(dǎo)致其周?chē)h(huán)境發(fā)生變化[12]。 我們進(jìn)行不同乙醇含量的熒光猝滅實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)BSA與AR92的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的參數(shù)列于表3。BSA與AR92的結(jié)合常數(shù)K值隨乙醇含量的升高而明顯降低，再次表明AR92結(jié)合于BSA的子域IIA。

2.3 AR92誘導(dǎo)BSA構(gòu)象變化的研究

2.3.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜

UV-Vis是研究小分子與蛋白相互作用，探討復(fù)合物形成和蛋白構(gòu)象變化的簡(jiǎn)便有效的工具，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化會(huì)影響生色氨基酸殘基的微環(huán)境，進(jìn)而使生色團(tuán)的吸收光譜發(fā)生改變[13]。 圖4顯示AR92在540nm附近有強(qiáng)吸收帶，在AR92中加入BSA，540nm處的峰值逐漸減小后上升并伴隨紅移，這表明BSA和AR92之間形成復(fù)合物，導(dǎo)致BSA的構(gòu)象變化。

2.3.2 同步熒光光譜

同步熒光光譜通過(guò)檢測(cè)光譜最大發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)來(lái)提供有關(guān)蛋白質(zhì)分子中發(fā)色團(tuán)(如色氨酸和酪氨酸殘基)附近微環(huán)境的信息[14]，進(jìn)而說(shuō)明AR92對(duì)BSA構(gòu)象的影響。 它涉及熒光激發(fā)和發(fā)射單色器的同時(shí)掃描，它們之間保持恒定的波長(zhǎng)間隔(Δλ)。 當(dāng)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的間隔Δλ=15nm時(shí)，光譜反映的是酪氨酸殘基的熒光特性；Δλ=60nm時(shí)，光譜反映的是色氨酸殘基的熒光特性。BSA隨AR92加入時(shí)的同步熒光光譜示于圖5。 觀察到Δλ=15nm和Δλ=60nm時(shí)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)均發(fā)生微弱藍(lán)移，表明BSA的微環(huán)境在AR92存在下發(fā)生輕微變化。 此外可以明顯看出，BSA-AR92體系在Δλ=60nm的猝滅程度強(qiáng)于Δλ=15nm，這表明，與酪氨酸殘基相比，色氨酸殘基對(duì)固有熒光的猝滅貢獻(xiàn)更多，即結(jié)合位點(diǎn)主要集中在BSA的色氨酸部分。

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜

3 結(jié) 論

在四個(gè)不同溫度、三種鹽濃度及不同乙醇含量下，采用多光譜技術(shù)分別研究BSA與AR92間相互作用。熒光猝滅數(shù)據(jù)及修正后的S-V圖表明BSA與AR92間通過(guò)靜態(tài)猝滅結(jié)合。 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)近似等于1、乙醇影響的研究及位點(diǎn)標(biāo)記物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)AR92與BSA子域IIA中的Trp-212相結(jié)合。 熱力學(xué)和鹽影響的結(jié)果表明BSA與AR92間的結(jié)合力主要為靜電力。 此外，UV-vis、同步熒光和FT-IR證實(shí)AR92與BSA的結(jié)合導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生變化。 這些結(jié)果可能為實(shí)際應(yīng)用中設(shè)計(jì)食品色素配比提供一定的參考價(jià)值。

[1] ZHAI H Y,SU Z H,CHEN Z G,et al.Molecularly imprinted coated graphene oxide solid-phase extractio monolithic capillary column for selective extraction and sensitive determination of phloxine B in coffee bean[J].Analytica Chimica Acta,2015,865：16-21.

[2] QI H,TAKANO H,KATO Y,et al.Hydogen peroxide-dependent photocytotoxicity by phloxine B,A xanthene-type food colorant [J].Biochimicaet Biophysica Acta,2011,1810：704-712.

[3] LIU R,CHENG Z J,LI T,et al.Investigation of two blood proteins binding to cantharidin and norcantharidin by multispectroscopic and chemometrics methods [J].Journal of Luminescence,2015,157：398-410.

[4] 李 田,程正軍,曹麗君,等.兩種食品防腐劑與牛血清白蛋白相互作用[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,30(4):366-373.

[5] BORISSEVITCH I E.More about the inner filter effect:corrections of stern-volmer fluorescence quenching constants are necessary at very low optical absorption of the quencher[J].Journal of Luminescence,1999,81:219-224.

[6] DOBREVA M A,GREEN R J,MUELLER-HARVEY I,et al.Size and molecular flexibility affect the binding of ellagitannins to bovine serum albumin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:9186-9194.

[7] 胡 松,曾 霓,劉英英,等.光譜學(xué)技術(shù)研究食品著色劑檸檬黃與牛血清白蛋白的結(jié)合性質(zhì)[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(工科版),2015,37(7):240-245.

[8] CHENG Z J,LIU R,JIANG X H.Spectroscopic studies on the interaction between tetrandrine and two serumalbumins by chemometrics methods[J].SpectrochimicaActa Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2013,115:92-105.

[9] TIAN Z Y,ZANG F L,LUO W,et al.Spectroscopic study on the interaction between mononaphthalimide spermidine (MINS) and bovine serum albumin(BSA)[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology,2015,142:103-109.

[10] LIANG J,CHENG Y P,HAN H Y.Study on the interaction between bovine serum albumin and cdte quantum dots with spectroscopic techniques[J].Journal of Molecular Structure,2008,892:116-120.

[11] BOLEL P,DATTA S,MAHAPATRA N,et al.Spectroscopic investigation of the effect of salt on binding of tartrazine with two homologous serum albumins:quantification by use of the debye hu ckel limiting Law and observation of enthalpy entropy compensation[J].The Journal of Physical Chemistry B,2012,116:10195-10204.

[12] DATTA S,MAHAPATRA N,HALDER M.pH-insensitive electrostatic interaction of carmoisine with two serum proteins:a Possible caution on its uses in food and pharmaceutical industry[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology,2013，124：50-62.

[13] 馬亞娣.幾種食品添加劑與蛋白質(zhì)、DNA相互作用的研究[D].江西:南昌大學(xué),2013.

[14] BI S Y,PANG B,WANG T J,et al.Investigation on the interactions of clenbuterol to bovine serum albuminand lysozyme by molecular fluorescence technique[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014,120:456-461.

[15] WANG Y X,LI L,SHENG L J,et al.Spectroscopic study on the inherent binding Information of cationic perfluorinated surfactant with bovine serum albumin[J].Journal of Fluorine Chemistry 2011,132:489-494.

Study on the Mechanism of Acid Red 92 Binding with Bovine Serum Albumin by Spectroscopic Techniques

CAO Lijun, CHENG Zhengjun, LI Tian, JIANG Xiaohui

(a.College of Chemistry and Chemical Engineering,b.Key Laboratory of Chemical Synthesis and Pollution Control of Sichuan Province,China West Normal University,Nanchong Sichuan 637009,China)

The interaction of Acid Red 92 (AR92) with Bovine Serum Albumin (BSA) was investigated via fluorescence,UV-vis and FT-IR spectra.The results showed that the interaction between BSA and AR92 belongs to a static quenching.The binding constant K and the binding-site number n were also calculated.The site marker competition experiments confirmed that AR92 binds to siteⅠ (subdomainⅡA) on BSA.The thermodynamic parametersΔG0<0,ΔH0<0,ΔS0>0 demonstrate that the main driving force of BSA and AR92 interacting with each other spontaneously is static electricity.The influences of salt and alcohol in different concentrations on their binding were studied.Furthermore,AR92-induced conformational changes of BSA were also analyzed.

spectroscopic technique;bovine serum albumin;acid red 92;fluorescence quenching;conformational change

1673-5072(2016)04-0396-07

2015-12-20

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(12ZA171)

曹麗君(1989—)，女，河南許昌人，碩士研究生，主要從事食品分析方面研究。

程正軍(1973—)，男，陜西鎮(zhèn)安人，副教授，主要從事食品和藥物分析方面研究。E-mail：ncczj1112@126.com

O65

A

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.04.007