薛 婭，耿文峰，伍春蓮,2

(1.西華師范大學 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.西南大學 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室，重慶 北碚 400715)

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紫杉醇與白藜蘆醇單體及聯(lián)合用藥誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡的比較研究

薛 婭1，耿文峰1，伍春蓮1,2

(1.西華師范大學 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.西南大學 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室，重慶 北碚 400715)

作者旨在對紫杉醇與白藜蘆醇單體及聯(lián)合用藥誘導HepG-2細胞凋亡進行比較研究。CCK-8法測定紫杉醇和白藜蘆醇對HepG-2細胞活性的影響；AO/PI雙染色法檢測HepG-2細胞凋亡形態(tài)；JC-1/線粒體膜電位檢測HepG-2細胞中線粒體的去極化程度；酶標儀檢測Caspase-3/8的活性。CCK-8法結果顯示無論是紫杉醇和白藜蘆醇還是兩種藥物聯(lián)合對HepG-2細胞都有抑制作用，其中聯(lián)合用藥組效果更優(yōu)，表現(xiàn)出明顯的時間依賴性；AO/PI染色和JC-1結果表明紫杉醇和白藜蘆醇及兩種藥物聯(lián)合皆使HepG-2細胞發(fā)生凋亡，聯(lián)合用藥組效果優(yōu)于單體組；Caspase-3/8的活性檢測發(fā)現(xiàn)在其凋亡過程中有Caspase-3/8蛋白酶參與其中。得出結論紫杉醇和白藜蘆醇兩種單體藥物以及兩種藥物聯(lián)合皆可通過線粒體途徑誘導HepG-2細胞凋亡，聯(lián)合用藥組藥效更強，且凋亡過程是caspase-3依賴性。

HepG-2；紫杉醇；白藜蘆醇；Caspase-3/8；細胞凋亡

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計肝癌是位居我國第二的癌癥“殺手”，潛伏性高、惡性度高、病情進展快，治療難度大、預后不良，故尋求新的更合理的抗肝癌藥物，對于肝癌的防患與治療都有重大意義。紫杉醇(Tax，Taxol)是從太平洋紫杉樹分離出來的一種高氧化二萜類天然產物，是一種廣譜抗癌藥物[1-3]，其抗癌機制是通過抑制微管解聚而阻止細胞有絲分裂引發(fā)細胞凋亡[4]。但很多研究指出Tax對人體有毒副作用，易產生抗藥性[5-8]。白藜蘆醇(Resveratrol,Res)屬于多酚化合物，白藜蘆醇具抗腫瘤[9]、抗炎癥[10-12]、抗菌等[13-14]作用，而且對正常的人體細胞副作用小[15]。已有報道Tax、Res及其聯(lián)合藥物通過線粒體途徑誘導喉癌細胞Hep-2凋亡[16]，Tax、Res兩者聯(lián)合應用作用肺癌PC9具有協(xié)同抗癌作用[17]。適宜濃度的Tax與RES聯(lián)合應用可顯著增強藥物對HepG-2細胞的抑制作用[18]。目前沒有關于Tax、Res單體及聯(lián)合用藥時對人肝癌細胞HepG-2的形態(tài)學和其誘導細胞調亡的分子機理的研究。因此，本研究以人肝癌細胞HepG-2為材料，探討Tax、Res單體及聯(lián)合用藥時對人肝癌細胞HepG-2的生長抑制作用及其誘導細胞調亡的信號途徑。為減少紫杉醇的用量，降低其對機體的毒副作用，并為開發(fā)肝癌綜合治療方案提供相關理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細 胞

人肝癌細胞株HepG-2(購于川北醫(yī)學院生化與分子免疫研究所)。

1.1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(購于Gibco公司，美國)；胎牛血清(購于杭州四季青生物制品公司，中國)；雙抗(青霉素，鏈霉素，購于Gibco公司，美國)；胰蛋白酶(購于Amresco公司，美國)；Tax(HPLC≥99%)和RES(HPLC≥98%)(購于瑞芬思公司，中國)；啶橙(AO)(購于Sigma公司，美國)；碘化丙錠(PI)(購于Sigma公司，美國)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(購于Beyotime公司，中國)；Caspase-3/8檢測試劑盒(購于BestBio公司，中國)。

1.1.3 儀 器

CO2培養(yǎng)箱(購于Sanyo公司，日本)；倒置顯微鏡(購于Olympus公司，日本)；自動酶標儀(購于Thermo公司，美國)；熒光顯微鏡(購于Olympus公司，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將人肝癌細胞HepG-2接種到RPMI-1640完全培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 白藜蘆醇、紫杉醇的配制

稱取一定量的Tax與Res藥品溶于DMSO，用RPMI-1640基礎培養(yǎng)液配制成10 mmol/L的高濃度母液備用(DMSO<0.1%)，實驗時再依次稀釋到所需的最終濃度。

1.2.3 CCK-8法測定白藜蘆醇和紫杉醇對肝癌HepG-2細胞活性的影響

取對數(shù)生長期的HepG-2細胞，制成均勻細胞懸液，接種于96孔板。24 h后加藥處理，使各組藥品終濃度為：Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)、Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)，設置空白對照組，每組設5個平行孔。在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內孵育12 h、24 h及36 h后，棄上清，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將96孔板于培養(yǎng)箱內再孵育4 h后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。細胞生長抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.4 JC-1/線粒體膜電位檢測細胞凋亡

病灶的典型層面及ADCtot值的測量方法見圖1。兩位醫(yī)師測得的ADCtot值分別為(1.54±0.27)×10-3、(1.55±0.28)×10-3mm2/s，ICC為0.994，一致性優(yōu)秀。以ADCtot中位數(shù)(1.5×10-3mm2/s)為標準分成高低值兩組進行比較。

取對數(shù)生長期細胞接種于鋪有滅菌蓋玻片的6孔板內，放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜，待細胞長至80%融合時，吸去6孔板內的培養(yǎng)液，加藥處理，使各組藥品終濃度為：Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)、Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)，設定空白對照組。孵育24 h后，取出6孔板根據(jù)JC-1說明書進行檢測。

1.2.5 AO/PI雙染色法檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞接種于有滅菌蓋玻片的6孔板中，放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜，待細胞長至80%融合時，吸去廢液，加藥處理，使各組中藥品的終濃度為： Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)、Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)，設定空白對照組。孵育24 h后，取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗細胞2～3次，晾干，95%的乙醇固定10 min，AO/PI 復合染液染色1 min，PBS洗凈并加入0.1 mol/L的CaCl2進行分色處理。完成后將各蓋玻片倒置放于載玻片上，30 s后熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 Caspase-3/8活性檢測

取對數(shù)生長期的細胞，以相同的細胞濃度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，接種24 h后，進行加藥處理，使各組藥品終濃度分別為：Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)、Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)，設定空白對照組，孵育12 h、24 h，根據(jù)Caspase-3/8活性檢測試劑盒說明書進行活性檢測。

2 結 果

2.1 藥物作用時間對細胞活性的影響

用Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)和Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)三組藥品處理HepG-2細胞12 h、24 h、36 h，結果發(fā)現(xiàn)：在加藥12 h后，這三組藥品對HepG-2細胞的抑制率分別可達22.55%、35.18%和49.10%；在經過24 h后，這三組藥品抑制率分別增長至57.85%、65.34%和75.72% 。在加藥36 h后，三組藥品的抑制率分別為64.01%、68.76%和79.53%(見圖1)。結果顯示：無論是白藜蘆醇和紫杉醇單體還是兩種藥物聯(lián)合對HepG-2細胞都有抑制作用，抑制作用呈時間依賴性，其中聯(lián)合用藥組效果更優(yōu)。

正常細胞在JC-1染色后呈現(xiàn)出高綠和高紅的熒光著色效果，如在同一濾光片下觀察則為黃綠色(如圖2-1)。凋亡細胞在雙色濾光片下可以觀察到高綠和低紅的熒光著色效果，在同一濾光片下為綠色(如圖2-2、圖2-3、圖2-4)。經過最終統(tǒng)計：在經過三組藥品處理24 h后，Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)和Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L) 中線粒體去極化細胞所占比例分別為：10.0%、46.1%、50.2%和63.1%。結果顯示：白藜蘆醇和紫杉醇單體或者兩種藥物聯(lián)合都破壞線粒體膜電位，誘導細胞凋亡反應，聯(lián)合組效果更明顯。

2.3 藥物對細胞凋亡的影響

用Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)和Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)三組藥品處理HepG-2細胞24 h，AO/PI染色結果如圖3所示。在視野中可見三種不同的細胞形態(tài)：活細胞(VN)發(fā)綠色熒光；早期凋亡細胞(VA)發(fā)橘紅色熒光；晚期凋亡細胞(NVA)發(fā)紅色熒光。結果顯示：空白對照組(如圖3-1)只有VN；Res與Tax單體用藥組(如圖3-2、圖3-3)有VA；Res +Tax組(如圖3-4)觀察到NVA，并且有凋亡小體出現(xiàn)。結果表明：白藜蘆醇和紫杉醇單體還是兩種藥物聯(lián)合都可以誘導細胞發(fā)生凋亡，其中聯(lián)合用藥組在相同時間內反應更強烈。

2.4 Caspase-8/3活性檢測結果

酶標儀檢測Caspase-8和Caspase-3活性(見圖4、圖5)。加藥12 h后，Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)和Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)三組藥品的Caspase-8活性測定值分別為0.144、0.151和0.183，與未處理組的0.078以及空白對照組的的0.063相比，有顯著升高(P<0.01)，而未處理組與空白對照組相比則無明顯差異(P>0.05)。加藥24 h后，三組藥品的Caspase-8活性測定值分別為0.139、0.146和0.161，與未處理組的0.069以及空白對照組的0.061相比，有顯著升高(P<0.01)。加藥12 h后，Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)和Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)三組藥品的Caspase-3活性測定值分別為0.133、0.138和0.154，與未處理組的0.063以及空白對照組的的0.057相比，有顯著升高(P<0.01)。而未處理組與空白對照組相比則無明顯差異(P>0.05)。加藥24 h后，三組藥品的Caspase-3活性測定值分別為0.154、0.161和0.191，與未處理組的0.089以及空白對照組的0.066相比，有顯著升高(P<0.01)。而未處理組與空白對照組相比依舊無明顯差異(P>0.05)。結果顯示：三組藥品皆可誘導HepG-2細胞發(fā)生凋亡，且凋亡的發(fā)生過程呈Caspase-3依賴性，其中聯(lián)合組藥效更強。三組藥品誘導HepG-2細胞發(fā)生凋亡的過程是通過Caspase-8激活的，提示有死亡受體途徑參與其中。

3 討 論

根據(jù)相關報道[18]，當二者聯(lián)合作用時，紫杉醇與白藜蘆醇分別在5～20 μmol/L以及100～1 000 μmol/L的濃度范圍內呈現(xiàn)出相加效果，本研究選擇適宜的濃度Res(200 μmol/L)、Tax(5 μmol/L)和Res(200 μmol/L)+Tax(5 μmol/L)三組藥品處理HepG-2細胞。CCK-8法測定白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合用藥對肝癌HepG-2細胞活性影響時發(fā)現(xiàn)無論是兩種單體用藥還是聯(lián)合用藥，它們對HepG-2細胞都有抑制作用，并表現(xiàn)出明顯的時間依賴性。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組不但藥效較單體藥品更強，其在較短時間內的作用亦更加明顯，反應速度明顯優(yōu)于RES與Tax單獨用藥組，潘洪明等[19]在胃癌的研究中也得出了相似結果。JC-1/線粒體膜電位檢測和AO/PI雙染色法分析細胞凋亡實驗中，發(fā)現(xiàn)無論是兩種單體藥物亦或兩種藥物聯(lián)合，它們皆可誘導HepG-2細胞調亡，其中聯(lián)合用藥組效果更優(yōu)，Res作用肝癌HepG-2后電子顯微鏡觀察到線粒體的跨膜電位明顯降低[20]，與本文研究結果一致。

Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡發(fā)生過程中有重要作用。其中Caspase-3與細胞的DNA斷裂、染色質凝集以及凋亡小體的發(fā)生皆有關系，是Caspase中的最關鍵分子。另外，在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中，Caspase-8位于整個凋亡信號通路的最上游，并且可被TNF激活，再被細胞表面受體激活后，Caspase-8可以通過級聯(lián)放大反應導致下游Caspase-3的活化[21]。在本論文中，各用藥組細胞的Caspase-3活性明顯高于未處理組和空白組，聯(lián)合用藥組的Caspase-3活性最強。說明Res、Tax和Res +Tax皆誘導HepG-2細胞發(fā)生凋亡過程是Caspase-3依賴的，Dhandayuthpani等[22]指出白藜蘆醇誘導凋亡的機制與上調促凋亡基因Caspase-3有關。為進一步了解紫杉醇與白藜蘆醇聯(lián)合用藥誘導HepG-2細胞發(fā)生凋亡的途徑，又對各用藥組細胞的Caspase-8活性進行了檢測，結果顯示各用藥組細胞的Caspase-8活性明顯高于未處理組和空白組，聯(lián)合用藥組的Caspase-8活性最強，綜合發(fā)現(xiàn)12 h的Caspase-8活性比24 h高，而且12 h的Caspase-3活性低于24 h。提示兩種單體藥物亦或兩種藥物聯(lián)合誘導HepG-2細胞調亡有通過死亡受體途徑參與其中。Garcia-Zepeda等[23]也揭示白藜蘆醇通過死亡受體途徑介導Caski、Siha及C33A細胞凋亡。

本研究從細胞活性與形態(tài)、酶活性等各個方面關于Res和Tax單獨用藥以及聯(lián)合用藥時對HepG-2細胞生長的抑制作用及誘導調亡的途徑做比較研究。聯(lián)合用藥和綜合療法作為目前生物醫(yī)學領域的研究熱點也開始逐漸應用于臨床[24]；并且為我們提供了腫瘤及癌癥治療的新思路，用以減少Tax這種化學抗癌藥物的用量，降低其對機體的毒副作用。Res和Tax所涉及的細胞凋亡過程到底是否還有其他凋亡途徑的參與需要進一步的研究。

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Comparative Study of Induced Apoptosis on the Effect of Paclitaxel and Resveratrol Combination Therapy in Hepatocellular HepG-2 cell

XUE Ya1,GENG Wenfeng1,WU Chunlian1,2

(1.Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation (China West Normal University)，Ministry of Education,Nanchong Sichuan 637009,China;2. State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environments and Bio-Resources of the Three Gorges Reservoir Region, Southwest University,Beibei Chongqing 400715,China)

This paper focuses on making a comparative study of resveratrol,paclitaxel and their joint anti-tumor mechanism.CCK-8 assay is used to evaluate the effect on the activity of HepG-2 cell;AO/PI staining for detecting HepG-2 cell’s morphology;JC-1 for detecting the degree of mitochondria polarization of HepG-2 cells;Microplate reader for detecting the activity of Caspase-3/8.The results showed that:both resveratrol and paclitaxel or the combination of the above two drugs could inhibit activity of the HepG-2 cells,in which the effect of the combined treatment group was better.Inhibition rate increased with time,which showed significant time-dependence;AO / PI staining and JC-1 showed that resveratrol,paclitaxel and the combination of the two drugs could induce apoptosis of HepG-2 cell and morphological changes,among which the combined treatment group was more significant.Caspase-3 / 8 activity assay found that Caspase-3 protease and death receptor pathway involved in the apoptosis process.The above results showed that resveratrol,paclitaxel and two drugs in combination can induced HepG-2 apoptosis,the combined treatment is more effective,and the apoptosis is caspase3 dependence.

HepG-2;paclitaxel;resveratrol;Caspase;apoptosis

1673-5072(2016)04-0385-05

2016-04-20

四川省教育廳重大培育項目(13CZ0029)；國博士后基金第54批面上一等資助項目(2013M540391)

薛 婭(1991—)，女，四川達州市人，碩士研究生，主要從事天然產物抗腫瘤研究。

伍春蓮(1976—)，女，四川彭州人，教授，博士，主要從事細胞和分子生物學的研究和教學。 E-mail：wcl_xj@163.com

Q291

A

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.04.005