■司慧民 穆偉峰 吳志明*

（1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州450008；2.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南新鄉(xiāng)453200）

黃曲霉毒素(Aflatoxin AFT)是由黃曲霉(Aspergil?lus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、特異曲霉(A.nomius)和假溜曲霉(A.pseudotamarii）這四種曲霉屬真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，主要有黃曲霉B1、B2、G1、G2(Aflatoxin B1、B2、G1、G2)，其中AFB1在飼料中最為常見(jiàn)，毒性最強(qiáng)，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。黃曲霉毒素早在1993年就被世界衛(wèi)生組織(WHO)劃定為Ⅰ類致癌物，畜禽食入后，能迅速破壞肝臟、腎臟、脾臟等解毒和免疫器官，降低免疫力，抑制生長(zhǎng)，并能在動(dòng)物組織中蓄積，嚴(yán)重危害動(dòng)物健康和畜產(chǎn)品安全。因此，對(duì)飼料及飼料原料中黃曲霉毒素的檢測(cè)工作顯得尤為重要，目前常用的檢測(cè)方法有薄層層析（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜分析（MS）和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。TLC法前處理繁瑣，提取凈化不夠理想，提取液雜質(zhì)較多時(shí)影響展開(kāi)斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，而雙向展開(kāi)雖避免了雜質(zhì)干擾，但增加了操作步驟和時(shí)間。ELISA方法操作簡(jiǎn)單，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。由于免疫親和層析柱根據(jù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，可特異性的將真菌毒素從提取液中分離出來(lái)，提高了熒光分析的靈敏性，降低檢測(cè)限，所以近幾年來(lái)被廣泛應(yīng)用于霉菌毒素的凈化處理。隨著國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定免疫親和柱凈化——高效液相色譜法》（GB/T 30955—2014）的發(fā)布實(shí)施，更促進(jìn)了免疫親和柱在飼料霉菌毒素檢測(cè)的廣泛推廣。國(guó)際、國(guó)內(nèi)的生物技術(shù)公司也紛紛推出各自的免疫親和層析柱，但不同品牌柱子的特異性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性也良莠不齊，故筆者選取兩家公司的黃曲霉毒素免疫親和柱進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）、熒光檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）、光化學(xué)衍生系統(tǒng)（美國(guó)Romer公司）、振蕩器（金壇市信誠(chéng)試驗(yàn)儀器制造廠）、玻璃纖維濾紙（英國(guó)Whatman公司）、PL403IC型電子分析天平（梅特勒上海有限公司）。

1.2 試驗(yàn)材料

A公司、B公司相同批次黃曲霉毒素免疫親和柱各一盒（25支裝）；黃曲霉毒素陽(yáng)性檢出飼料兩份，編號(hào)：Y1、Y2；空白飼料一份，編號(hào)為K；甲醇，乙腈，氯化鈉。AFB1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)品（上海安普科學(xué)儀器有限公司），PBS緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T—6682中二級(jí)用水規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液和流動(dòng)相用水符合一級(jí)用水規(guī)定。提取所需試劑為分析純，其他試劑均為色譜級(jí)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相:甲醇∶水(45∶55)溶液，流速:0.8 ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。光化學(xué)衍生系統(tǒng):光化學(xué)衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測(cè)器）。柱溫30℃。進(jìn)樣量20 μl。

2.2 陽(yáng)性樣品制備

準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素混合貯備液，50℃水浴下，將苯吹干，用適量的甲醇∶水（45∶55）溶液定容為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，AFB1、B2、G1、G2濃度分別為10、3、10、3 ng/ml，準(zhǔn)確移取該工作液加入到兩份空白飼料中做AFB1、B2、G1、G2含量分別為10、3、10、3 μg/kg的陽(yáng)性添加，樣品編號(hào)分別為T(mén)1、T2。

2.3 提取

準(zhǔn)確稱取樣品K、Y1、Y2、T1、T2（精確至0.1mg）25 g于250 ml具塞錐形瓶中，加入5.0 g氯化鈉及準(zhǔn)確加入125 ml甲醇∶水（8∶2）溶液，振蕩30 min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取5 ml濾液并加入15 mlPBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾1～2次，至濾液澄清，以備A、B公司免疫親和柱用。

2.4 凈化

將以上兩組提取液分別按照A、B兩公司免疫親和柱說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凈化處理，最終定容于進(jìn)樣瓶中，供色譜檢測(cè)用。

2.5 色譜測(cè)定

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B和以上兩組試液按照“試驗(yàn)方法 2.1”液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)與AFB1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖比較響應(yīng)值得到試樣中的質(zhì)量濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 液相圖譜結(jié)果與分析

將以上樣品通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)獲得圖譜見(jiàn)圖1～圖6，其中圖3和圖5為用空白飼料K做陽(yáng)性添加后分別用A、B兩公司黃曲霉毒素免疫親和柱凈化后的結(jié)果。圖3和圖5對(duì)比顯示：圖3雜峰較多，雜質(zhì)峰面積較大，AFB2拖尾嚴(yán)重，四種毒素的峰型較差；圖4和圖6為同一個(gè)陽(yáng)性樣品Y1分別用A、B兩公司免疫親和柱凈化后的結(jié)果，對(duì)比顯示：該飼料為AFB1檢出，但圖4基本未檢出且很難對(duì)其進(jìn)行定量。據(jù)此分析：雖然同為黃曲霉毒素免疫親和柱，但A公司免疫親和柱凈化作用較差，對(duì)毒素的特異性吸附能力弱，從而影響樣品的檢測(cè)結(jié)果。

圖1 AFB1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖2 空白樣品K圖譜

圖3 T1圖譜（A公司柱子凈化）

圖4 Y1圖譜（A公司柱子凈化）

圖5 T1圖譜（B公司柱子凈化）

圖6 Y1圖譜（B公司柱子凈化）

3.2 數(shù)據(jù)結(jié)果與分析（見(jiàn)表1、表2）

將以上樣品圖譜進(jìn)行積分處理并與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜響應(yīng)值比較，可獲得最終樣品殘留量，從表1和表2的對(duì)比可知：使用A公司柱子的樣品檢測(cè)結(jié)果明顯低于B公司，其中陽(yáng)性添加樣品T1用A公司柱子凈化后AFB1、B2、G1、G2的回收率通過(guò)檢測(cè)結(jié)果并經(jīng)添加量計(jì)算分別為67.3%、74.3%、68.2%、77.7%；而用B公司柱子凈化后回收率分別為104.3%、97.3%、97.7%、98.3%，A公司免疫親和柱的回收率遠(yuǎn)低于B公司柱子，這也導(dǎo)致表1、表2中陽(yáng)性樣品Y1、Y2的最終檢測(cè)結(jié)果差別較大。

表1 A公司柱子凈化后檢測(cè)結(jié)果（μg/kg）

表2 B公司柱子凈化后檢測(cè)結(jié)果（μg/kg）

4 討論

免疫親和柱凈化樣品原理是真菌毒素單克隆抗體通過(guò)免疫親和吸附作用特異性地將毒素分子從待檢樣品的復(fù)雜組分中分離出來(lái)，所以單克隆抗體的特異性直接影響到免疫親和柱的凈化作用。一些公司生產(chǎn)單克隆抗體大多是通過(guò)動(dòng)物直接免疫獲得的抗體產(chǎn)品，多數(shù)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)規(guī)模制備，所以抗體產(chǎn)量低、特異性差、產(chǎn)品不穩(wěn)定?？贵w與活化基體的偶聯(lián)方式也影響抗體的親合力，隨機(jī)偶聯(lián)時(shí)，基體與抗體的結(jié)合位點(diǎn)不固定，抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可能被占用，或者擠占了抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致與抗體失去親和力。所以隨機(jī)偶聯(lián)后的免疫活性一般較低；定向偶聯(lián)是先將protein A或protein G固定在基體上，protein A或protein G只與IgG的Fc區(qū)相結(jié)合，然后用二甲基庚二酸酯等化學(xué)交聯(lián)劑使抗體（多抗或單抗）與pro?tein A或protein G定向偶聯(lián)，抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)則處于游離狀態(tài)。黃昕等的試驗(yàn)研究表明，使用protein A的定向偶聯(lián)抗原結(jié)合容量是隨機(jī)偶聯(lián)的1.8倍，說(shuō)明定向偶聯(lián)有助于提高免疫親和吸附劑的抗原結(jié)合容量。所以，同樣是免疫親和柱但其凈化效果卻大相徑庭，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，在按照GB/T 30955—2014進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)很難發(fā)現(xiàn)免疫親和柱對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響，所以其它檢測(cè)機(jī)構(gòu)在使用該方法時(shí)務(wù)必考察免疫親和柱的各種性能后再?zèng)Q定是否購(gòu)買使用，選擇使用正確的免疫親和柱來(lái)保證檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)公正。