蓋春蕾，張元發(fā)，葉海斌

(1.山東省海洋生物研究院，海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266104；2.即墨市海洋與漁業(yè)局，山東即墨 266200)

凡納濱對蝦體內(nèi)大黃苷的藥代動力學(xué)特征*

蓋春蕾1，張元發(fā)2，葉海斌1

(1.山東省海洋生物研究院，海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266104；2.即墨市海洋與漁業(yè)局，山東即墨 266200)

【目的】研究大黃苷(Rhein)在凡納濱對蝦體內(nèi)的吸收、分布和代謝規(guī)律，并制定臨床給藥方案?！痉椒ā恳? mg/kg劑量的大黃苷一次性肌肉注射凡納濱對蝦，利用高效液相色譜(HPLC)檢測其在凡納濱對蝦血淋巴、肝胰臟、肌肉和鰓組織中的藥物濃度-時間變化，并通過3P87軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析其在凡納濱對蝦體內(nèi)的藥代動力特征?！窘Y(jié)果】大黃苷在4種組織里的達(dá)峰時間(Tmax)較早，分別為0.17 h、2.73 h、0.44 h、0.23 h；消除半衰期(T1/2Ke)較短，分別為2.13 h、2.36 h、3.12 h、3.72 h；在房室模型選擇上，大黃苷在4種組織中的最適藥動模型均符合一級吸收一室模型?！窘Y(jié)論】肌注大黃苷后，藥物在凡納濱對蝦各組織中分布廣泛、吸收快、清除能力強(qiáng)。大黃苷在凡納濱對蝦鰓部的濃度較高，這為利用其治療凡納濱對蝦爛鰓病提供理論依據(jù)。

大黃苷 凡納濱對蝦 藥代動力學(xué) 高效液相色譜

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)，又稱南美白對蝦，具有對鹽度適應(yīng)范圍廣、生長速度快、養(yǎng)殖周期短和產(chǎn)量高等優(yōu)點，在我國沿海及內(nèi)地均有凡納濱對蝦的養(yǎng)殖[1]。對蝦養(yǎng)殖量一旦超過環(huán)境容納量[2]，就會導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，從而引發(fā)對蝦各類細(xì)菌病、病毒病，嚴(yán)重制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而藥物代謝動力學(xué)(pharmacokinetics)是闡述藥物在機(jī)體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律的一門科學(xué)，能定量描述藥物在生物機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，國內(nèi)外學(xué)者對對蝦的藥代動力學(xué)進(jìn)行豐富的研究。磺胺-2，6-二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)與土霉素(Oxytetracycline,OTC)在凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)和日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)體內(nèi)的藥代動力學(xué)在國外均有相關(guān)研究[4-6]。國內(nèi)對中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和凡納濱對蝦的藥動學(xué)研究較多，其次是日本囊對蝦和斑節(jié)對蝦；涉及的藥物主要有呋喃唑酮[7]、新諾明[8]、恩諾沙星[9-10]、諾氟沙星[11]、米諾沙星[12]、麻保沙星[13]、氟苯尼考[14-15]以及磺胺類[16-18]。另外中草藥提取物在對蝦體內(nèi)的藥代動力學(xué)也有相關(guān)報道，如李小彥等[19]報道中藥提取物黃芩苷在對蝦體內(nèi)的藥物代謝。中草藥大黃及大黃制劑目前廣泛應(yīng)用于對蝦病害防治中，可有效地治療養(yǎng)殖對蝦爛鰓病、爛眼病、紅腿病、對蝦甲殼潰瘍病等細(xì)菌性疾病[20]?！颈狙芯壳腥朦c】大黃苷是大黃的主要有效成分，而其在凡納濱對蝦體內(nèi)的藥代動力學(xué)卻未見有相關(guān)報道。對大黃苷在凡納濱對蝦體內(nèi)的藥物代謝研究，可以幫助人們更科學(xué)地制定給藥方案，使其更好地應(yīng)用于對蝦細(xì)菌性病害防治。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用高效液相色譜技術(shù)測定肌肉注射大黃苷后，藥物在凡納濱對蝦組織中血淋巴、肝胰臟、肌肉及鰓的濃度變化，分析大黃苷在凡納濱對蝦體內(nèi)的代謝規(guī)律，為應(yīng)用大黃及大黃制劑在對蝦病害防治及制定給藥方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

HEWLETT PACKARD 1100高效液相色譜系統(tǒng)，水浴氮吹儀，IKA T10高速分散勻漿機(jī)，TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，潔康PS-30超聲波清洗機(jī)，富勒姆FJY0502-UVF型純水機(jī)，Mettler電子天平，金怡旋渦混合器；大黃苷標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純甲醇，色譜純磷酸，分析純高氯酸，分析純乙醚，超純水。

1.2 方法

1.2.1 凡納濱對蝦的暫養(yǎng)

凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)平均體重(15.9±2.3)g，實驗前于循環(huán)水槽中暫養(yǎng)一周，投喂優(yōu)質(zhì)對蝦配合飼料。水溫條件26～28℃，海水鹽度29‰～31‰，pH值為7.8，充氣養(yǎng)殖，每天早晚兩次吸污。試驗前選取健康對蝦個體，禁食24 h。

1.2.2 給藥及樣品的采集

精確稱取大黃苷標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.8 mg/mL注射藥液，將配制好的藥液以5 mg/kg的劑量一次性肌肉注射凡納濱對蝦，輕推注入。給藥后0.25 h、0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h取凡納濱對蝦的血淋巴、肝胰臟、肌肉及鰓為樣品，每個時間點取樣8尾，-20℃冰箱中冷凍保存以備檢測。

1.2.3 樣品的處理

樣品處理參照王新宏等[21]對大黃蒽醌甙元的分析方法：樣品自然解凍后取0.5 mL血淋巴或稱取0.5 g肌肉、肝胰臟、鰓組織，加入0.3 mL 3 mol·L-1高氯酸溶液與2 mL乙醚，16 000 r·min-1勻漿5 s；再用2 mL乙醚清洗刀頭，合并提取液；漩渦5 min，5 000 r·min-1離心20 min，取乙醚層水浴(60±2)℃氮氣吹干。殘渣用0.5 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)孔徑0.2 μm濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)樣測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18 250 mm×4.6 mm (5 μm)；流動相：甲醇/0.5%磷酸(80∶20，V∶V)經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后，超聲波脫氣15～20 min；流速：0.8～1 mL·min-1；柱溫：室溫；紫外檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取1 g空白組織(血淋巴、肝胰臟、肌肉、鰓)，加入0.06 mg·L-1、0.4 mg·L-1、2 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)大黃苷溶液1 mL。按1.2.2項方法處理后20 μL進(jìn)樣測定。以濃度Y為縱坐標(biāo)，峰面積X為縱坐標(biāo)，分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，分別求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以引起2～3倍基線噪音的峰面積對應(yīng)的大黃苷濃度作為最低檢測限。

1.2.6 回收率和精密度的測定

(1)回收率

將血淋巴、肝胰臟、肌肉和鰓4份空白組織中適量加入大黃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為0.5 mg·L-1、2 mg·L-1、25 mg·L-1，按1.2.2項方法處理測定。每個濃度梯度重復(fù)進(jìn)樣4次，計算得出各樣品峰面積的平均值，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算得出大黃苷的濃度值Ca。

另取4份空白組織，不加入大黃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2項方法處理后，各加入1 mL濃度為0.5 mg·L-1、2 mg·L-1、25 mg·L-1的大黃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.2 μm孔徑濾膜過濾后，進(jìn)樣測定。計算得出各樣品峰面積的平均值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算得到大黃苷的濃度值Cb。利用Ca與Cb相比即可計算出萃取回收率=Ca÷Cb×100%。

(2)精密度

測定已經(jīng)按上述1.2.2項方法處理配制的3份含大黃苷系列血淋巴，濃度分別為0.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1，一天內(nèi)每隔2 h測定，共5次，連續(xù)5 d重要測定。通過計算得出其日內(nèi)和日間變異系數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出大黃苷在4種組織中的藥物濃度。利用3P87藥動學(xué)軟件進(jìn)行分析，擬合出最佳房室模型，并計算出藥動學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測限

大黃苷標(biāo)準(zhǔn)液在0.06～50.00 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)具有良好的相關(guān)性；以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到大黃苷在血淋巴、肝胰臟、肌肉、鰓組織中的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y=0.012 6X+0.183 8(R2=0.998 9)，Y=0.011 6X-0.003 9 (R2=0.993 6)，Y=0.012 4X+0.298 3(R2=0.995 2)，Y=0.015 8X-0.165 3(R2=0.999 9)。本實驗條件下采用紫外檢測器的最低檢測限為0.02 mg/L(S/N=2)。

2.2 回收率與精密度

大黃苷回收率為79.61%～96.71%，日內(nèi)變異系數(shù)在5.67%～8.23%，日間變異系數(shù)為3.08%～9.33%(表1)?；厥章屎途芏仁菦Q定測定方法準(zhǔn)確性和可靠性的重要依據(jù)，回收率不應(yīng)低于70%,日內(nèi)和日間精密度的平均變異系數(shù)應(yīng)控制在10%以內(nèi)，本方法回收率穩(wěn)定，變異系數(shù)小，均符合方法學(xué)的要求。

2.3 凡納濱對蝦體內(nèi)藥物濃度變化

凡納濱對蝦單劑量肌肉注射大黃苷后，藥物在血淋巴和鰓中達(dá)到最高濃度所需時間最短，在0.25 h以內(nèi)；在肝胰臟的所需時間最長，為3 h左右。其中，肌肉中的藥物濃度要明顯低于其它3種組織。整體上藥物在4種組織中的達(dá)峰時間較早，能夠較快地被吸收，從而在對蝦各組織達(dá)到最大濃度(表2)。

表1 大黃苷在對蝦4種組織中的回收率及其在血淋巴中的精密度測定

Table 1 Recovery of rhein in four tissues ofPenaeusvannameiand its precision in hemolymph

濃度Concentration(mg·L-1)大黃苷的回收率Recoveryofrhein(n=4,%)變異系數(shù)Coefficientofvariation(%)血淋巴Hemolymph肝胰臟Hepatopancreas肌肉Muscle鰓Gill日內(nèi)變異系數(shù)Withindayprecision日間變異系數(shù)Daytodayprecision0.591.2486.4680.9187.496.319.332.086.3496.7186.6686.418.233.5825.082.4189.4679.6181.325.673.08

表2 不同時間點凡納濱對蝦體內(nèi)的大黃苷濃度(X±SD，n=6)

Table 2 The concentration of rhein inPenaeusvannameibody in different time(X±SD，n=6)

采樣時間Time(h)藥物濃度Theconcentrationofdrugs(mg·L-1)血淋巴Hemolymph肝胰臟Hepatopancreas肌肉Muscle鰓Gill0.00NDNDNDND0.252.14±0.581.58±0.490.41±0.122.47±0.780.501.58±0.061.39±0.290.42±0.061.89±0.121.001.25±0.081.19±0.490.44±0.121.41±0.023.000.61±0.192.15±0.220.21±0.031.28±0.075.000.48±0.132.09±0.670.16±0.010.98±0.37.000.18±0.011.67±0.690.14±0.011.01±0.479.000.14±0.011.45±0.23ND0.45±0.3812.00ND0.31±0.23ND0.13±0.01

Note:ND mean not determined

2.4 藥動學(xué)參數(shù)

將藥物濃度-時間數(shù)據(jù)經(jīng)3P87藥動軟件處理后，擬合大黃苷在4種組織中的濃度-時間的變化過程，選擇出最適房室模型，結(jié)果顯示大黃苷在凡納濱對蝦對蝦4種組織中，其房室模型均符合一級吸收一室模型。所得的主要藥動學(xué)參數(shù)如表3所示，其中A為藥時曲線在橫坐標(biāo)截距；Ka為一級吸收速率常數(shù)；Ke為藥物的消除速率常數(shù)；V為表觀分布容積；T1/2Ka為吸收半衰期；T1/2Ke為消除半衰期； CL(s)為總體清除率；Tmax為單劑量給藥后出現(xiàn)最高血藥濃度的時間；Cmax為單劑量給藥后的最高血藥濃度；AUC為藥時曲線下總面積。

表3 大黃苷在凡納濱對蝦4種組織中的藥動學(xué)參數(shù)

Table 3 Pharmacokinetic parameters of rhein in four tissues ofPenaeusvannamei

參數(shù)Parameters組織Tissues血淋巴Hemolymph鰓Gill肌肉Muscle肝胰臟HepatopancreasA(mg·L-1)1.932.170.5014.94Ke(h-1)0.330.190.220.29Ka(h-1)26.7321.110.400.45V(L·kg-1)2.622.3310.350.96T1/2Ka(h)0.030.030.081.54T1/2Ke(h)2.133.723.122.36CL(s)(L·(h·kg)-1)0.850.432.300.28Tmax(h)0.170.230.442.73AUC(mg·L-1·h)5.8511.542.1817.56

3 討論

3.1 大黃苷在凡納濱對蝦體內(nèi)代謝房室模型選擇

藥物在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄的過程是一個動態(tài)變化過程，因此建立一個數(shù)學(xué)模型，來模擬機(jī)內(nèi)藥物的動態(tài)變化規(guī)律具有非常重要意義。通過3P87軟件對4種組織中藥物濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示大黃苷在凡納濱對蝦血淋巴、肌肉、鰓和肝胰臟中最佳藥動學(xué)模型均符合一級吸收一室模型。這與草魚灌胃大黃水煎液后的一室模型相同[22]，而與灌胃哺乳動物大鼠[23]、灌服家兔大黃[24]以及人口服大黃水提物[25]后大黃苷在血漿中的二室模型不同，這表明大黃苷在對蝦和草魚等水產(chǎn)動物體內(nèi)的代謝相對簡單，藥物到達(dá)其體內(nèi)各組織后，能較快達(dá)到平衡。

3.2 大黃苷在凡納濱對蝦體內(nèi)的分布特征

表觀分布容積(V)是提供外來化合物在體內(nèi)分布的重要信息[25]。V值越大，表明藥物分布越廣，其與血漿蛋白結(jié)合程度也就越低。本實驗中大黃苷在凡納濱對蝦血淋巴中的V為2.62 L·kg-1，表觀分布容積大于土霉素0.87 L·kg-1(文獻(xiàn)[26])、恩諾沙星1.21 L·kg-1(文獻(xiàn)[27])、氟甲喹0.53 L·kg-1(文獻(xiàn)[28])，與家兔的(3.01±0.95)L·kg-1(文獻(xiàn)[29])接近，遠(yuǎn)高于其在人血漿中的(0.06±0.01)L·kg-1(文獻(xiàn)[30])。這說明大黃苷與凡納濱對蝦血漿蛋白結(jié)合程度較低，其在對蝦體內(nèi)的分布廣泛，能在其體內(nèi)多個組織發(fā)揮藥效。

3.3 大黃苷在凡納濱對蝦體內(nèi)各組織中的動力學(xué)參數(shù)比較

以5 mg·kg-1的劑量一次性肌肉注射大黃苷，藥物在對蝦各組織中的達(dá)峰時間Tmax如下：對蝦血淋巴為0.17 h，時間最短，其后依次是對蝦鰓0.23 h、肌肉0.44 h和肝胰臟2.73 h。其在凡納濱對蝦血淋巴中的達(dá)峰時間，較刺參直接大黃苷體腔注射后藥物達(dá)峰時間0.26 h還要短，這與對蝦腹部的背面和腹面動脈之間有一組血竇直接通往心臟的生理結(jié)構(gòu)有關(guān)[31]。

藥時曲線下面積(AUC)代表藥物的生物利用度，反映藥物進(jìn)入血循環(huán)的總量。大黃苷在血淋巴、鰓、肌肉及肝胰臟4種組織中的AUC分別為5.85 mg·L-1·h、11.54 mg·L-1·h、2.18 mg·L-1·h和17.56 mg·L-1·h。在同一劑量下，對蝦肝胰臟中大黃苷的藥物濃度最高，這與大黃歸胃、大腸、肝經(jīng)的中醫(yī)歸經(jīng)理論相符[32]。李蘭生等[33]認(rèn)為藥物吸收后大部分積蓄在肝胰臟，而后緩慢釋放到血淋巴并分布到肌肉等組織。本實驗中大黃苷在凡納濱對蝦肌肉中的含量最低，肝胰臟與鰓中藥物含量較高，藥物能夠集中于肝胰臟、鰓等部位發(fā)揮藥效。

藥物消除半衰期T1/2Ke是當(dāng)藥物濃度降低到原來濃度1/2所需要的時間(t)，其長短能反映出體內(nèi)藥物消除速度[34]。大黃苷在血淋巴、鰓、肌肉及肝胰臟4種組織中的T1/2Ke分別為1.13 h、3.72 h、3.12 h及2.36 h，均低于4 h，屬于快速消除類藥物[35]。大黃苷在血淋巴中T1/2Ke最短，消除最快，而在鰓中T1/2Ke消除最慢，且鰓組織中的藥時曲線下面積AUC較大，藥物可以較好的被吸收利用，可以間隔4～5 h給藥用以對蝦爛鰓病治療。

4 結(jié)論

大黃苷在凡納濱對蝦各組織中能較快達(dá)到藥物濃度峰值，具有吸收快、分布廣泛，清除能力強(qiáng)、消除速度快等特點。鰓是大黃苷對凡納濱對蝦主要的效應(yīng)器官，這為利用大黃苷治療凡納濱對蝦爛鰓病提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：米慧芝)

Pharmacokinetic Characteristics of Rhein in the Body ofPenaeusvannamei

GAI Chunlei1，ZHANG Yuanfa2，YE Haibin1

(1.Key Laboratory of Mariculture Disease Treatment,Marine Biology Institute of Shandong Province，Qingdao，Shandong，266104，China；2.Jimo Ocean and Fishery Bureau，Jimo，Shandong，266200，China)

【Objective】The absorption,distribution and metabolism of rhein in Penaeus vannamei were studied,and the clinical dosing regimen was established.【Methods】We analysed the pharmacokinetics of rhein in Penaeus vannamei，blood，hepatopancreas，muscle and gill were sampled after muscle injecting with a single dose of rhein (5 mg/kg)，the contents of rhein was determined by HPLC，and 3P87 software were used to analyse the data processing.【Results】Rhein in four kinds of tissue in the peak time (Tmax) early and were 0.17 h，2.73 h，0.44 h，0.23 h；elimination half-life (T1/2Ke) short were 2.13 h，2.36 h，3.12 h，3.72 h；in compartment model choice，the four organizations rhein optimum pharmacokinetic model are suitable for a one-compartment model.【Conclusion】Rhein after intramuscular injection，the drug vannamei tissues peak time is short,wide distribution，rapid absorption,strong scavenging ability.The concentration of rhein vannamei gills is high,which provides a theoretical basis for using it to treat gill disease of Penaeus vannamei.

rhein，Penaeus vannamei，pharmacokinetics，HPLC

http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20161201.0849.004.html

2016-10-29

蓋春蕾(1982-)，男，碩士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動物病害防治研究，E-mail:chunlei317@163.com。

*國家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(編號CARS-47)資助。

S948

A

1002-7378(2016)04-0282-06

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間:2016-12-01 【DOI】10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20161201.002