張 靜

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中醫(yī)兒科，廣東 廣州 510623)

調(diào)節(jié)性T細胞、白細胞介素-17與嬰幼兒喘息樣支氣管炎辨證分型的關(guān)系

張 靜

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中醫(yī)兒科，廣東 廣州 510623)

目的 探討調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)、白細胞介素-17(IL-17)與嬰幼兒喘息樣支氣管炎辨證分型的關(guān)系。方法 選擇健康兒童20名、肺脾氣虛型喘息樣支氣管炎患兒20例及脾腎陽虛型喘息樣支氣管炎患兒20例，檢測其外周血Treg細胞、IL-17含量。6個月后隨訪各組再次發(fā)作喘息患兒的人數(shù)及次數(shù)，檢測其外周血Treg細胞、IL-17含量。結(jié)果 3組Treg細胞比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。6個月后隨訪3組Treg細胞比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 Treg細胞、IL-17與嬰幼兒喘息樣支氣管炎的首次發(fā)作及再次喘息發(fā)作存在密切關(guān)系。在喘息樣支氣管炎緩解階段，應(yīng)用健脾益肺補氣的方法對肺脾氣虛型患兒進行體質(zhì)治療及預(yù)防，從根本上改善患兒的生活質(zhì)量。

哮喘；辨證分型；白細胞介素6；T淋巴細胞

嬰幼兒喘息樣支氣管炎[1]是最常見的兒科呼吸系統(tǒng)疾病，此病有反復(fù)發(fā)作趨勢，部分患兒甚至可能發(fā)展為支氣管哮喘。因此，為了提高中醫(yī)對喘息樣支氣管炎患兒的治療及預(yù)防再次發(fā)作喘息，本研究主要觀察喘息樣支氣管炎緩解階段肺脾氣虛型和脾腎陽虛型嬰幼兒和正常兒童的外周血中調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)、白細胞介素-17(IL-17)含量，以及其相互之間的關(guān)系，旨在探討Treg細胞、IL-17與嬰幼兒喘息樣支氣管炎辨證分型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷指標 西醫(yī)診斷參照《諸福棠實用兒科學》[2]中喘息樣支氣管炎診斷標準；中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)兒科學》[3]中哮喘緩解期診斷標準，辨證分型為肺脾氣虛型、脾腎陽虛型[4-5]。

1.1.2 納入標準 患兒：年齡<3周歲；符合中西醫(yī)診斷標準及中醫(yī)辨證分型標準；首次被診斷為喘息樣支氣管炎收治入院。健康兒童：年齡<3周歲；無喘息發(fā)作史；無過敏性疾??；一級親屬無過敏性疾病。

1.1.3 排除標準 支氣管異物、喉發(fā)育不良、支氣管肺發(fā)育不良、先天性氣道畸形、支氣管擴張、重癥肺炎等可能引起喘息的疾患；有心、腦、腎基礎(chǔ)疾病者；嚴重的免疫缺陷病和遺傳代謝性疾病。健康兒童：父母有哮喘病史；外周血嗜酸粒細胞≥0.04。

1.2 一般材料 選擇2014-01-01—2014-06-30到廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童保健門診體檢的健康兒童20名，廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心呼吸科住院患兒肺脾氣虛型和脾腎陽虛型各20例，均首次診斷為喘息樣支氣管炎。健康組20名，男9名，女11名；年齡1～36個月，平均(23.65±5.02)個月；體質(zhì)量8～15 kg，平均(11.60±1.63) kg；肺脾氣虛組20例，男11例，女9例；年齡1～36個月，平均(22.05±7.10)個月；體質(zhì)量8～15 kg，平均(11.76±1.53) kg；脾腎陽虛組20例，男12例，女8例；年齡1～36個月，平均(22.20±3.44)個月；體質(zhì)量8～15 kg，平均(11.18±0.91) kg。3組性別、年齡、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。6個月后隨訪肺脾氣虛組、脾腎陽虛組再次發(fā)作喘息患兒的人數(shù)及次數(shù)，檢測其外周血Treg細胞、IL-17含量，以我院醫(yī)生門診病歷診斷為喘息性支氣管炎納入再次喘息發(fā)作的依據(jù)。

1.3 檢測方法

1.3.1 Treg細胞 Treg細胞檢測試劑盒購自BD Biosciences公司。抽取研究對象外周靜脈血2 mL，取50 μL乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝全血，加入10 μLCD25-FITC，2.5 μL CD4-APC，5 μLCD127-PE，然后混勻，室溫避光15 min，后取2 mL溶血素混勻，再室溫避光10 min，平衡試管質(zhì)量后置于水平式離心機內(nèi)離心1 500 r/min ，5 min，去上清，取2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)混勻，水平式離心機內(nèi)離心1 500 r/min，5 min，去上清，450 μL PBS懸浮，最后上機檢測。用流式細胞儀CELL Quest Pro軟件收集數(shù)據(jù)并分析。

1.3.2 IL-17 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自安迪生物科技(上海)有限公司。IL-17標本采集及細胞分離：抽取全部研究對象外周靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝。全血離心后收集血漿-80 ℃凍存待ELISA檢測。本試劑盒使用雙抗體夾心法測定標本中IL-17水平。用純化的IL-17抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IL-17，再與辣根化氧化物酶(HRP)標記的羊抗人抗體結(jié)合，構(gòu)成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過完全洗滌后加底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣本中的IL-17呈正相關(guān)。用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值(OD值)，通過標準曲線計算樣品中IL-17含量。

2 結(jié) 果

2.1 3組Treg細胞、IL-17比較 見表1。

表1 3組Treg細胞、IL-17比較

健康組(n=20)肺脾氣虛組(n=20)脾腎陽虛組(n=20)Treg細胞(%)7.7250±1.615187.5195±1.506117.9945±1.36052IL-17(pg/mL)3032.87±814.41*4034.20±1279.002865.77±520.26*

與肺脾氣虛組比較，*P<0.05

由表1可見，3組Treg細胞比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 肺脾氣虛組、脾腎陽虛組隨訪再次喘息患兒與健康組Treg細胞、IL-17比較 見表2。

表2 肺脾氣虛組、脾腎陽虛組隨訪再次喘息患兒與健康組Treg細胞、IL-17比較 ±s

與肺脾氣虛組比較，*P<0.05

由表2可見，3組Treg細胞比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肺脾氣虛組IL-17高于健康組、脾腎陽虛組(P<0.05)，健康組與脾腎陽虛組IL-17比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

喘息樣支氣管炎的免疫學基礎(chǔ)是輔助性T細胞2(Th2)為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)，氣道存在以肥大細胞和嗜酸粒細胞參與為主的氣道慢性過敏性炎癥[6]。目前認為喘息樣支氣管炎的反復(fù)發(fā)作是由于免疫調(diào)節(jié)紊亂引起的。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞是機體內(nèi)重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)呼吸道炎癥過程的細胞，并可能在過敏性哮喘的發(fā)病和發(fā)展機制中起到關(guān)鍵性作用。Treg細胞[7]通過分泌抑制性細胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和細胞間直接接觸介導(dǎo)免疫抑制，IL-10是具有抗炎作用的細胞因子，可抑制促炎細胞因子的合成，亦可抑制嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞及肥大細胞的致炎作用。CD4+、CD25+Treg細胞的主要作用表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性，是外周免疫耐受形成機制的主要組成部分。其主要作用機制為分泌抑制性細胞因子(IL-10和TGF-β)、表達細胞表面分子[細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)]及Foxp3等。國外研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能誘導(dǎo)Foxp3表達，促進CD4+、CD25+Treg細胞增殖，從而抑制呼吸道嗜酸粒細胞浸潤為主的炎癥，降低呼吸道變態(tài)反應(yīng)[8]。吳奎等[9]發(fā)現(xiàn)哮喘鼠中CD4+、CD25+Treg細胞顯著低于正常鼠，還發(fā)現(xiàn)Treg細胞相關(guān)因子IL-10水平降低。而另一研究[10]亦顯示，呼吸道過敏癥模型小鼠的體內(nèi)存在Treg細胞的缺陷，將CD4+、CD25+Treg細胞轉(zhuǎn)移到模型鼠體內(nèi)可以抑制過敏性炎癥的發(fā)生。

國外臨床研究中哮喘急性發(fā)作期及持續(xù)期CD4+、CD25+Treg細胞表達較緩解期及正常對照組降低，癥狀緩解階段CD4+CD25+Treg細胞表達增加接近正常[11]，由此可見Treg細胞的免疫抑制作用在保持機體的自身耐受性中發(fā)揮著決定性作用[12]。彭力等[13]在臨床實驗中觀察喘息嬰幼兒CD4+、CD25+Treg細胞百分率的表達顯著低于對照組，Treg細胞可能在嬰幼兒喘息疾病活動中發(fā)揮重要作用，可能參與了嬰幼兒喘息的發(fā)病機制。而在本研究中顯示Treg細胞在健康兒童組外周血中與肺脾氣虛和脾腎陽虛組患兒的差別并不大，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，此結(jié)果與彭力等[13]觀察喘息嬰幼兒Treg細胞明顯低于對照組得出的結(jié)論有所不同，但由于彭力等[13]觀察的指標為喘息發(fā)作時進行的檢測，而本研究是喘息緩解階段進行的免疫學檢測，這可能提示在嬰幼兒喘息緩解后Treg細胞的表達逐漸增加接近正常。這一結(jié)果與國外研究哮喘緩解后Treg細胞表達增加接近正常組的結(jié)論相近[11]。也進一步提示嬰幼兒喘息與哮喘的免疫學指標高度相似。從另一方面也表示在嬰幼兒喘息的發(fā)作中可能與調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少有相關(guān)性。

Th17細胞是由Infante-Duarte C等[14]首次提出的一群不表達IL-4或γ-干擾素(IFNγ)，卻高水平分泌IL-17的新的Th亞群。Th17細胞的主要效應(yīng)因子是IL-17。近年來發(fā)現(xiàn)，IL-17 是T 細胞來源細胞因子，Th17細胞分泌的IL-17是強大的促炎細胞因子，它可以促使氣道黏液腺分泌大量黏液，增加氣道的高反應(yīng)性，從而在哮喘氣道重塑的過程中發(fā)揮重要作用。施宇衡等[15]發(fā)現(xiàn)嚴重的過敏性哮喘患者Th17細胞的反應(yīng)增加，Th17細胞及其分泌的細胞因子IL-17為哮喘加重的關(guān)鍵因素。而IL-17基因[16]缺陷小鼠不易引發(fā)哮喘，說明在哮喘的發(fā)作中Th17細胞發(fā)揮了重要作用。但目前國內(nèi)動物實驗[17]亦表明哮喘急性發(fā)作期氣道IL-17表達和產(chǎn)生增加，介導(dǎo)中性粒細胞性炎癥，臨床資料證實IL-17在哮喘急性發(fā)作期氣道表達增加，提示Th17在兒童哮喘發(fā)病中可能有重要作用。Th17細胞的發(fā)現(xiàn)使我們對疾病免疫發(fā)病機制，尤其是嬰幼兒喘息樣支氣管炎的發(fā)病機制突破僅有的Thl/Th2模式的局限。過去許多認為是Th1或Th2細胞介導(dǎo)的疾病，現(xiàn)在證實Th17細胞亦起重要作用或主要作用。

本研究中，健康兒童外周血IL-17 與肺脾氣虛組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與脾腎陽虛組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肺脾氣虛組再發(fā)喘息患兒IL-17含量與健康兒童比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示喘息樣支氣管炎肺脾氣虛型患兒喘息癥狀的反復(fù)發(fā)作可能與IL-17含量有明顯直接關(guān)系。而脾腎陽虛組再發(fā)喘息患兒IL-17含量與健康兒童比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示在嬰幼兒再發(fā)喘息中IL-17與肺脾氣虛型患兒的關(guān)系比脾腎陽虛型患兒的相關(guān)性有可能要更加密切。肺脾氣虛組患兒IL-17含量均高于健康組和脾腎陽虛組，而IL-17具有上調(diào)黏液基因表達、促進黏液分泌的作用，并可間接促進氣道組織纖維化而參與哮喘的氣道重塑過程。張亞梅等[18]報道兒童喘息樣支氣管炎病情嚴重程度與外周血漿中IL-17表達水平呈正相關(guān)，因此IL-17含量的增多對喘息的發(fā)作有一定程度的影響。并且在喘息發(fā)病中辨證為肺脾氣虛型患兒IL-17的高表達也提示此類患兒發(fā)展為慢性哮喘的可能性較高，并不利于喘息恢復(fù)，所以在治療預(yù)防中要重視此類患兒的體質(zhì)調(diào)理。魯雙喜[19]在玉屏風散對哮喘小鼠Th17相關(guān)細胞因子表達影響研究中發(fā)現(xiàn)玉屏風散對哮喘小鼠急性期IL-17有抑制作用，能減輕哮喘小鼠肺組織細支氣管及血管周圍炎性細胞浸潤，改善氣道炎癥狀態(tài)，減少氣道上皮黏液分泌。

在喘息樣支氣管炎緩解階段，我們可以應(yīng)用健脾益肺補氣法對肺脾氣虛型患兒進行體質(zhì)治療及預(yù)防，從根本上改善此類患兒的生活質(zhì)量。

(指導(dǎo)老師：陳曉剛 劉 華)

[1] 饒花平，孟艷妮，陳璐.嬰幼兒喘息嗜酸性粒細胞趨化因子的檢測及其臨床診斷價值[J].中國醫(yī)師雜志，2011，13(4):540-541.

[2] 胡亞美.諸福棠實用兒科學[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015:1174.

[3] 汪受傳.中醫(yī)兒科學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2004：78-79.

[4] 盧海燕.哮喘患兒的中醫(yī)體質(zhì)類型及中醫(yī)藥干預(yù)方案研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學，2010.

[5] 高艷.小兒哮喘中醫(yī)證候類型專家問卷分析[J].山東中醫(yī)藥大學學報，2009，33(3):188-189.

[6] 鮑一笑.嬰幼兒喘息診治進展[J].臨床兒科雜志，2008，26(1):1-4.

[7] 周辰，陳軍浩，殷凱生.輔助性T細胞17和調(diào)節(jié)性T細胞在哮喘小鼠中的失衡表達及其意義[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2010，9(1)：28-31.

[8] Shi HZ，Qin XJ.CD4CD25 regulatory T lymphocytes in allergy and asthma[J].Allergy，2005，60(8)：986-995.

[9] 吳奎，孫鯤，畢玉田，等.哮喘小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量及功能的改變[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2005，4(6):455-458.

[10] Wozakowska-Kap on B，Bartkowiak R，Grabowska U，et a1.B-type natriuretic peptide level after sinus rhythm restoration in patients with persistent atrial fibrillation-clinical significance[J]．Kardiol Pol，2010，68(7):781-786.

[11] Xue K，Zhou Y，Xiong S，et al.Analysis of CD4+CD25+regulatory T cells and Foxp3 mRNA in the peripheral blood of patients with asthma[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2007，27(1):31-33.

[12] 張藍方，郝云良.Th17細胞和Treg細胞與某些疾病關(guān)系的研究進展[J].臨床血液學雜志，2011，24(2)：189-192.

[13] 彭力，鐘禮立，黃寒，等.CD4+CD25+、CD4+CD25hig調(diào)節(jié)性T細胞和Foxp3 mRNA在嬰幼兒喘息中的表達及意義[J].重慶醫(yī)學，2012，41(5)：445-448.[14] Infante-Duarte C, Horton HF, Byrne MC, et al.

Microbial lipopeptides induce the production of IL-17 in Th cells[J].J Immunol，2000，165(11):6107-6115.

[15] 施宇衡，時國朝，萬歡英，等.過敏性哮喘患者外周血Th17細胞及IL-17水平的變化[J].診斷學理論與實踐，2010，9(5)：473-476.

[16] Nakae S，Komiyama Y，Nambu A，et al.Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice,causing suppression of allergic cellular and humoral responses[J].Immunity，2002，17(3):375-387.

[17] 陳杰華，劉恩梅，陳坤華，等.哮喘急性發(fā)作期患兒外周血Th17水平及其功能初步研究[J].細胞與分子免疫學雜志，2009，25(4):359-361，363.

[18] 張亞梅，王菊芳，李莉.Th17/IL-17水平在兒童哮喘發(fā)病中的變化及臨床意義[J].臨床肺科雜志，2015，20(11):2083-2085.

[19] 魯雙喜.玉屏風散對哮喘小鼠Th17相關(guān)細胞因子表達影響的初步研究[D].昆明：云南中醫(yī)學院，2012.

(本文編輯：習 沙)

Correlation among regulatory T cells, interleukin-17 and syndrome differentiation of asthmatoid bronchitis in infants

ZHANGJing.

DepartmentofTraditionalChinesePediatrics,GuangzhouMedicalCenterforWomenandChildreninGuangdongProvince,Guangdong,Guangzhou510623

Objective To study the correlation among regulatory T cells (Treg cells), interleukin-17 (IL-17) and syndrome differentiation of asthmatoid bronchitis in infants. Methods 20 healthy infants, 20 asthmatoid bronchitis infants with lung and spleen QI deficiency type and 20 asthmatoid bronchitis infants with spleen-kidney Yang deficiency type were selected. The contents of peripheral-blood Treg cells and IL-17 were measured. The people counting and attack frequency of acute exacerbation of asthma after 6 months follow-up were observed and the contents of peripheral-blood Treg cells and IL-17 were measured. Results There were no statistical differences on Treg cells among three groups (P>0.05). The IL-17 in lung and spleen QI deficiency group was higher than healthy and spleen-kidney Yang deficiency group (P<0.05), and there were no statistical differences on IL-17 between healthy group and spleen-kidney Yang deficiency group (P>0.05). Conclusion There are intimate connection among Treg cells, IL-17 and the first and second attack of asthma in infants with asthmatoid bronchitis. In the remission stage of asthmatoid bronchitis, the therapy of strengthening spleen, invigorating lung and nourishing QI is able to treat and prevent the infants with lung and spleen QI deficiency constitution, which can fundamentally improve the quality of life.

Asthma; Syndrome differentiation; IL-6; T lymphocyte

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.007

張靜(1983—)，女，主治醫(yī)師，碩士。從事中醫(yī)兒科臨床工作。

R725.6；R725.622.5；R331.125

A

1002-2619(2016)11-1630-05

2016-07-14)