樓亞玲+++曹恒斌

[摘要] 目的 探討丙戊酸（VPA）聯(lián)合姜黃素（CUR）對人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7R增殖抑制的影響及其作用機(jī)制。方法 分別用100、10、1、0.1、0.01 μg/mL阿霉素（ADR）作用于MCF-7R細(xì)胞和敏感株細(xì)胞MCF-7細(xì)胞72 h后，MTT法測定ADR對各組細(xì)胞的抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），判定MCF-7R細(xì)胞的耐藥情況；用20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA、空白對照及320、160、80、40、20、10、5 μmol/L CUR、空白對照分別作用于MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h，用MTT法分析細(xì)胞增殖抑制率；將VPA 0.625 mmol/L分別與10、20、40 μmol/L CUR聯(lián)合作用于MCF-7R細(xì)胞 24、48及72 h后，用MTT法分析聯(lián)合用藥細(xì)胞增殖抑制率及Q值；將VPA 0.625 mmol/L與10 μmol/L CUR聯(lián)合作用于MCF-7R細(xì)胞 48 h后，高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。 結(jié)果 MCF-7R與MCF-7細(xì)胞IC50分別為（60.30±20.30）、（5.59±1.87）μg/mL，MCF-7R細(xì)胞耐藥倍數(shù)約為10.8倍。不同濃度VPA或VPA處理對數(shù)生長期MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h后，結(jié)果提示對VPA或VPA對MCF-7R細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度和時(shí)間相關(guān)（P < 0.05）；聯(lián)合用藥結(jié)果顯示，在相同作用時(shí)間下，CUR濃度越高，抑制率越高（P < 0.05）。金正均Q值法判斷兩藥聯(lián)用結(jié)果顯示，0.625 mmol/L VPA與10 μmol/L CUR聯(lián)合作用48 h時(shí)兩藥有明確的相加作用（P < 0.05），而其他聯(lián)合用藥及作用時(shí)間表現(xiàn)出兩藥拮抗作用，其中各聯(lián)合用藥組作用48、72 h時(shí)的Q值比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而作用24 h時(shí)Q值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。單用0.625 mmol/L VPA見少量細(xì)胞減少；10 μmol/L CUR也可導(dǎo)致較多細(xì)胞死亡，兩藥物聯(lián)用時(shí)較單獨(dú)用藥細(xì)胞數(shù)量減少明顯。 結(jié)論 VPA及CUR在低劑量聯(lián)用時(shí)存在相加作用，高劑量聯(lián)用時(shí)兩者呈現(xiàn)拮抗作用。

[關(guān)鍵詞] 丙戊酸；姜黃素；MCF-7R；增值抑制

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）10（a）-0021-04

Inhibitory effect of HDACi VPA combined with CUR on proliferation of breast cancer MCF-7R cells

LOU Yaling CAO Hengbin

Department of Pharmacy， Huzhou Central Hospital， Zhejiang Province， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To investigate the proliferation and inhibition of valproic acid （VPA） and curcumin （CUR） on human breast cancer cells （MCF-7R）， and the effect of proliferation mechanism on MCF-7R cell. Methods The different concentrations of 100， 10， 1， 0.1， 0.01 μg/mL ADR on MCF-7 and MCF-7R cells after 72 h ， the proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay， and inhibitory concentration （IC50） was computed； the different concentrations of 20， 10， 5， 2.5， 1.25， 0.625， 0.3125 mmol/L VPA and blank control， the different concentrations of 320， 160， 80， 40， 20， 10， 5 μmol/L CUR and blank control on MCF-7R cell after 24， 48 and 72 h， the proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay and the proliferation inhibition rate value was computed； 0.625 mmol/L VPA was combined with 10， 20， 40 μmol/L CUR on MCF-7R cell after 24， 48 and 72 h， the cell proliferation inhibition rate was analyzed with MTT assay and the proliferation inhibition rate value was computed； 0.625 mmol/L VPA and 10 μmol/L CUR on MCF-7R cell after 48 h， the changes of cells number and morphology were observed. Results IC50 of MCF-7R and MCF-7 cell was （60.30±20.30）， （5.59±1.87） μg/mL， respectively， the resistant factor of MCF-7R cell was about 10.8. The effect of different concentrations of VPA and CUR on MCF-7R cell after 24， 48 and 72 h was depended on the concentrations and time （P < 0.05）； the combined effect showed that， the higher concentrations of CUR， the bigger IR-values on the same time （P < 0.05）. The Jin zheng-jun Q-value method showed that， only 0.625 mmol/L VPA combined with 10 μmol/L CUR had additive effection （P < 0.05）， other combination groups and dealt time had antagonistic effection （P < 0.05）， and the Q-value of each combination group after 48， 72 h had statistically significant difference （P < 0.01）， while the 24 h group did not have significant difference （P > 0.05）； the reducing of the number of cells in 0.625 mmol/L VPA treatment group was not obvious， many apoptosis was leaded by 10 μmol/L CUR， and the combination of VPA 0.625 mmol/L and CUR 10 μmol/l decreased more than the monotherapy group. Conclusion VPA combined with CUR has synergistic effect on low dosage， but has antagonistic effect on high dosage.

[Key words] Valproic acid； Curcumin； MCF-7R； Inhibitory effect

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，20世紀(jì)末的統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界每年約有130萬人被診斷為乳腺癌，在我國，乳腺癌在城市的發(fā)病率為女性腫瘤的第二位，在農(nóng)村為第五位[1]?；熌退幒娃D(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是乳腺癌難以根治的主要原因，化療有效率僅為40%～80%[2]?，F(xiàn)研究認(rèn)為，丙戊酸（VPA）和姜黃素（CUR）對人類腫瘤細(xì)胞均存在較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且毒副作用小[3-6]，將它們應(yīng)用于臨床治療腫瘤及改善腫瘤耐藥問題均表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本研究主要采用VPA聯(lián)合CUR作用于MCF-7R和MCF-7細(xì)胞，在體外評價(jià)兩藥合用效果并探討其合用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

VPA（Sigma公司）；阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：130707）；CUR（Alddin公司，批號：C1213019）；四氮唑藍(lán)、胎牛血清及DMSO（Amresco公司）；MEM、DMEM、青霉素/鏈霉素及胰蛋白酶（Gibco公司）；人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7R和人乳腺癌敏感株MCF-7（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7R（MCF-7）細(xì)胞由含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL），鏈霉素（100 U/mL）培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)，于37℃（5%CO2，95%空氣），飽和濕度，待細(xì)胞生長至85%左右融合，用0.25%胰蛋白酶液消化后進(jìn)行傳代。MCF-7R耐藥細(xì)胞除上述條件外，需加入1.0 μg/mL的阿霉素，以維持細(xì)胞的耐藥性，實(shí)驗(yàn)前2周停藥。CUR由二甲基亞砜（DMSO）稀釋為100 mmol/L母液，分裝，避光-20℃冰箱保存，2周內(nèi)有效，使用前以無血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，使DMSO終濃度<0.1%；VPA由PBS液稀釋為1 mol/L母液，0.22 μm針式濾器過濾除菌，分裝，-20℃冰箱保存，使用前以無血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測（MTT） 取對數(shù)生長期MCF-7R及MCF-7細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄去上清培養(yǎng)液，用含10%FBS的MEM及DMEM培養(yǎng)液重懸并打勻后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞液稀釋至5×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37℃、5%CO2過夜貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的ADR溶液，使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL，藥物作用72 h后，每孔加入20 mL MTT溶液（2.5 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后，吸棄細(xì)胞上清液，每孔加入100 mL DMSO，輕微振蕩，待甲瓚完全溶解后用自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度值（OD值）。取對數(shù)生長期MCF-7R細(xì)胞按上述方法處理，37℃、5%CO2過夜貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的VPA溶液，使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L，24、48、72 h后得到相應(yīng)濃度及時(shí)間下的增殖抑制率，并根據(jù)這個(gè)結(jié)果選擇后續(xù)試驗(yàn)VPA濃度；取對數(shù)生長期MCF-7R細(xì)胞，按上述方法處理，加入不同濃度的CUR溶液，使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為320、160、80、40、20、10、5 μmol/L，24、48、72 h后得到相應(yīng)濃度及各時(shí)間下的增殖抑制率及各時(shí)間段的半數(shù)抑制濃度，根據(jù)結(jié)果選擇后續(xù)試驗(yàn)濃度，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白對照，分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用酶標(biāo)儀測定OD值，細(xì)胞增殖的抑制率（IR%）=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組）×100%。

1.2.3 合并用藥效果評價(jià) 評價(jià)聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞的抑制是否有協(xié)同作用，參照金正均Q值法判斷：Q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb），其中Ea+b為合并用藥的抑制率，Ea和Eb分別為A藥和B藥單獨(dú)用藥的抑制率。Q<0.85為拮抗，0.85≤Q<1.15為相加，Q≥1.15為協(xié)同[7]。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期MCF-7R細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為0.625 mmol/L VPA、10 μmol/L CUR、0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR與聯(lián)合處理48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；IC50用Probit回歸法計(jì)算，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADR對MCF-7R/MCF-7細(xì)胞增殖的影響

用100、10、1、0.1、0.01 μg/mL ADR處理對數(shù)生長期的MCF-7R細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞72 h，根據(jù)OD值計(jì)算抑制率，用Probit回歸法計(jì)算IC50。阿霉素對MCF-7R細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞作用的IC50分別是（60.30±20.30）、（5.59±1.87）μg/mL，MCF-7R耐藥倍數(shù)約為10.8倍。

2.2 VPA對MCF-7R細(xì)胞的增殖抑制作用

20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mmol/L VPA及空白對照處理對數(shù)生長期MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h，根據(jù)OD值計(jì)算抑制率，提示各組VPA對MCF-7R細(xì)胞抑制作用與濃度和時(shí)間相關(guān)（P < 0.01），見表1。因VPA在臨床治療應(yīng)用中濃度監(jiān)測安全范圍為50～100 μg/mL，盡量減少藥物細(xì)胞毒性作用對結(jié)果的影響，該實(shí)驗(yàn)VPA濃度應(yīng)選為0.625 mmol/L[8]。

2.3 CUR對MCF-7R細(xì)胞的增殖抑制作用

320、160、80、40、20、10、5 μmol/L CUR及空白對照處理對數(shù)生長期的MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h后，根據(jù)OD值計(jì)算抑制率。結(jié)果，CUR對MCF-7R細(xì)胞抑制作用與濃度和時(shí)間相關(guān)（P < 0.01），見表2。Probit回歸法計(jì)算CUR 24、48及72 h IC50，分別為23.7、49.8和38.6 μmol/L，該實(shí)驗(yàn)CUR后續(xù)濃度為10、20、40 μmol/L。

2.4 VPA聯(lián)合CUR對MCF-7R細(xì)胞增殖的影響

0.625 mmol/L VPA分別作用于40、20、10 μmol/L CUR處理對數(shù)生長期的MCF-7R細(xì)胞24、48及72 h后，根據(jù)OD值計(jì)算抑制率。結(jié)果顯示，在相同作用時(shí)間下，抑制率的高低取決于CUR的濃度，CUR濃度越高，抑制率越大（P < 0.01）。

2.5 金正均Q值法判斷兩藥聯(lián)用效果

采用金正均Q值公式計(jì)算Q值，分析VPA聯(lián)合CUR對MCF-7R細(xì)胞增殖抑制率的增強(qiáng)是否具有協(xié)同作用。Q<0.85為拮抗，0.85≤Q<1.15為相加，Q≥1.15為協(xié)同。結(jié)果顯示，當(dāng)CUR為10 μmol/L作用48 h時(shí)，兩藥物聯(lián)合有明確相加作用（P < 0.01）；而各聯(lián)合用藥組作用24、72 h時(shí)及20、40 μmol/L CUR聯(lián)合0.625 mmol/L VPA作用48 h時(shí)均表現(xiàn)出拮抗作用。各聯(lián)合用藥組作用48、72 h時(shí)Q值比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），作用24 h時(shí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.6 聯(lián)合用藥對細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的影響

空白組與單獨(dú)使用0.625 mmol/L VPA組48 h后細(xì)胞增殖狀態(tài)良好，數(shù)目形態(tài)未見明顯變化；單獨(dú)使用10 μmol/L CUR組數(shù)目稍有減少，0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR處理組，數(shù)目形態(tài)發(fā)生較為明顯改變，可見少量細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積變小，大小不等，培養(yǎng)基中可見少許的細(xì)胞碎片及死亡細(xì)胞。

3 討論

VPA是廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和分化，抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖等途徑達(dá)到較強(qiáng)抗腫瘤活性[3-6]。VPA可增強(qiáng)多種抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的療效，例如VPA增強(qiáng)順鉑對小細(xì)胞肺癌的作用，其機(jī)制是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，VPA抑制組蛋白去乙酰化酶3的表達(dá)，上調(diào)P21，并抑制Bcl-xL的表達(dá)，從而增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用[9]。另外VPA聯(lián)合RAS抑制劑抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖，因阻礙Survivin與Aurora A的表達(dá)[10]。

CUR具有一定的抗腫瘤作用，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長、促進(jìn)分化、誘導(dǎo)凋亡等作用[4，11]。CUR可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號，CUR可通過作用不同分子靶點(diǎn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的抑制，例如上調(diào)cdk抑制劑、P53，下調(diào)CyclinD1、cdk-1、cdk-2、NF-kB[12]，并可增強(qiáng)順鉑或奧沙利鉑抗腫瘤作用，并能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[13-15]，且與下調(diào)P-gp蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP-1等蛋白表達(dá)有關(guān)[16-17]。CUR的多效活性取決于其復(fù)雜的化學(xué)組成，故其可作用于多條信號途徑，包括NF-kB、Akt、生長因子、依賴于Nrf2細(xì)胞保護(hù)途徑、轉(zhuǎn)移和血管生長途徑等[18]。

Fortunati等[19]將適合人體濃度的VPA作用于MCF-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)P21表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯于G1期，下調(diào)Bcl-2及上調(diào)Bak表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。另有文獻(xiàn)報(bào)道VPA與CUR聯(lián)合作用于人白血病細(xì)胞，通過作用于組蛋白乙?；福瑢?dǎo)致白血病細(xì)胞的凋亡[20]，然而目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道VPA和CUR聯(lián)合作用于乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7R。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的VPA及CUR作用于MCF-7R細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間與濃度依賴性，兩藥聯(lián)用時(shí)0.625 mmol/L VPA+40 μmol/L CUR組各時(shí)間點(diǎn)抑制率均為最高，但在此濃度下兩藥并未呈示相加或協(xié)同作用。只有0.625 mmol/L VPA+10 μmol/L CUR作用48 h時(shí)提示存在相加作用（P < 0.05），其余各組均呈拮抗作用，但作用24 h各組抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。從對細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的影響發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量比單藥作用減少明顯，但不顯著。兩藥在低劑量聯(lián)用時(shí)存在相加作用，高劑量聯(lián)用時(shí)呈拮抗作用，推測兩藥存在同一作用靶點(diǎn)或通路，尚待進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2016-06-03 本文編輯：任 念）