張萌，伍季，夏中友，李云祥，范俊

(1川北醫(yī)學院，四川南充63700；2 南充市中心醫(yī)院)

?

·臨床研究·

膀胱尿路上皮癌組織中ING4、p53、Ki-67蛋白的表達變化及意義

張萌1，伍季2，夏中友2，李云祥2，范俊2

(1川北醫(yī)學院，四川南充63700；2 南充市中心醫(yī)院)

目的 探討膀胱尿路上皮癌組織中生長抑制因子4(ING4)、p53、Ki-67蛋白的表達變化及意義。方法 采用免疫組化法分別檢測60例份膀胱尿路上皮癌組織、60例份癌旁組織、37例份膀胱正常黏膜組織中ING4、p53、Ki-67蛋白的表達，并分析其與膀胱癌患者病理分級、臨床分期及臨床資料的關系。Spearman 等級相關分析癌組織中三者的相關性。結(jié)果 膀胱尿路上皮癌組織、癌旁組織及膀胱正常黏膜組織ING4蛋白的陽性表達率分別為70.0%(42/60)、100%(60/60)、97.2%(36/37)，p53的陽性表達率分別為96.7%(58/60)、13.3%(8/60)、13.5%(5/37)，Ki-67蛋白的陽性表達率分別為91.7%(55/60)、11.7%(7/60)、2.7%(1/37)，與膀胱尿路上皮癌組織比較，膀胱正常黏膜組織和癌旁組織中ING4蛋白陽性表達率高，p53、Ki-67蛋白陽性表達率低(P均<0.05)。ING4蛋白在膀胱尿路上皮癌的表達與病理分級及臨床分期有關(P均<0.05)；p53和Ki-67蛋白表達與病理分級、臨床分期及腫瘤的發(fā)病個數(shù)有關(P均<0.05)。 ING4與p53、Ki-67蛋白呈負相關(rs分別為-0.301、-0.315，P均<0.05)；p53與Ki-67蛋白呈正相關(rs=0.625，P<0.05)。結(jié)論 膀胱尿路上皮癌組織中ING4蛋白水平降低，p53和Ki-67蛋白水平升高，其均參與癌的發(fā)生、發(fā)展。

膀胱尿路上皮腫瘤；生長抑制因子4；p53；Ki-67蛋白

膀胱癌在全世界屬于第五大常見惡性腫瘤，約占全部惡性腫瘤的3.2%，在我國其發(fā)病率位居泌尿系腫瘤首位，男性患病率是女性患病率的3～4倍，發(fā)病年齡主要處于50～70歲[1]。75%～85%的膀胱尿路上皮癌屬于非肌層浸潤性膀胱癌，其他為肌層浸潤性和轉(zhuǎn)移性癌[2]。尿路上皮癌從形態(tài)上和遺傳學上是多樣化的腫瘤，擁有不同的癌細胞系和特定的細胞結(jié)構改變[3]。近年雖然許多腫瘤標記物相繼用于膀胱癌的預后判斷, 但迄今為止尚無可供臨床常規(guī)使用的腫瘤標記物。為尋找新的腫瘤標記物，本研究觀察了ING4、p53、Ki-67在膀胱尿路上皮癌組織中的表達變化，并探討了其與臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院和南充市中心醫(yī)院2014～2015年經(jīng)手術切除的并有完整臨床資料的膀胱尿路上皮癌組織60 例份, 其中患者男43例、女17例, 年齡45～80歲、平均61歲，年齡﹥60歲31例、≤60歲29例。癌旁組織60例份，均取自患者距離癌組織邊緣約2 cm以上的正常膀胱黏膜組織。病理分級按世界衛(wèi)生組織2004年標準確定, 低級別29例、高級別31例。臨床病理分期按國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準確定,非肌層浸潤性膀胱癌(Tis～T1)28例、肌層浸潤性膀胱癌(T2～T4)32例。膀胱正常黏膜組織37例份是通過膀胱切開取石及開放前列腺切除術所收集?；颊吣?3例、女7例。

1.2 組織ING4、p53、Ki-67蛋白相對表達的檢測 采用免疫組化SP法。鼠抗人p53 IgG單克隆抗體、鼠抗人Ki-67核抗原、免疫組織化學染色SP試劑、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物制品有限公司,鼠抗人ING4多克隆抗體購自英國Abcam公司，按試劑盒說明書操作。以扁桃體腺體切片作Ki-67的陽性對照；以直腸癌切片作p53的陽性對照；以睪丸切片作ING4的陽性對照；用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 由2位病理科主任醫(yī)師在臨床和病理資料不知曉的情況下獨立觀察切片,并進行染色評分。使用半定量的評分系統(tǒng)來評估抗體的染色效果，計數(shù)5個高倍視野或500個細胞。ING4陽性表達為細胞核和(或)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；p53 陽性表達為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒；Ki-67陽性表達為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。按染色強度計分:0 分為無色，1分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；按陽性細胞所占百分比計分：0 分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2 分為陽性細胞數(shù)11%～50%，3分為陽性細胞數(shù)51%～75%，4分為陽性細胞數(shù)>75%；染色強度與陽性細胞所占百分比乘積得染色系數(shù)：0～2為-，≥3為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。等級資料的兩樣本比較采用秩和檢驗,相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ING4、p53、Ki-67蛋白在膀胱尿路上皮癌、癌旁和膀胱正常黏膜組織中的相對表達 膀胱尿路上皮癌、癌旁和膀胱正常黏膜組織中，ING4蛋白的陽性表達率分別為70.0%(42/60)、100%(60/60)、97.2%(36/37)，p53蛋白的陽性表達率分別為96.7%(58/60)、13.3%(8/60)、13.5%(5/37)，Ki-67蛋白的陽性表達率分別為91.7%(55/60)、11.7%(7/60)、 2.7%(1/37)，與膀胱尿路上皮癌組織比較，膀胱正常黏膜組織和癌旁組織中ING4蛋白陽性表達率高，p53、Ki-67蛋白陽性表達率低(P均<0.05)。在膀胱正常黏膜組織與癌旁組織中，ING4、p53、Ki-67蛋白陽性表達率比較，P均>0.05。

2.2 ING4、p53、Ki-67蛋白表達與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關系 ING4蛋白在膀胱尿路上皮癌的表達與患者的性別、年齡、初發(fā)、復發(fā)以及腫瘤的大小、位置、個數(shù)無相關性(P均>0.05)，與病理分級及臨床分期有關(P均<0.05)；p53和Ki-67蛋白與病理分級、臨床分期及腫瘤的發(fā)病個數(shù)有關(P均<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、初發(fā)或復發(fā)均無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 膀胱尿路上皮癌組織中ING4、p53、Ki-67蛋白三者之間的相關性 ING4與p53、Ki-67蛋白呈負相關(rs分別為-0.301、-0.315，P均<0.05)；p53與Ki-67蛋白呈正相關(rs=0.625，P<0.05)。

3 討論

ING4基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因，為第2類腫瘤生長抑制因子家族的一員，由Shiseki等[4]在2003年發(fā)現(xiàn)并從人腦垂體中被分離出來。該基因定位于染色體12p13-31區(qū)域內(nèi)，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，基因跨距13 kb。ING4基因編碼蛋白包括一個具有高度保守的植物同源結(jié)構域和一個核定位信號(NLS)區(qū)[5]。文獻報道，ING4基因在許多腫瘤中如膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、頭頸部的鱗狀上皮細胞癌、惡性黑色素瘤、肝細胞癌等中起抑制作用。隨著對ING4研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)ING4具有的功能包括增強p53活性，維持細胞間的接觸性抑制，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、低氧誘導因子的活性，參與組蛋白乙?；种颇[瘤生長、新生血管形成，影響細胞周期，促進細胞凋亡、細胞自噬，增強腫瘤對化療藥物的敏感性[6,7]。但是有關ING4基因在膀胱癌組織中研究的文獻不多。本試驗結(jié)果提示，ING4基因在膀胱尿路上皮癌組織中的表達量下降，并隨著腫瘤病理級別或臨床分期的升高其表達水平下降，而ING4蛋白在正常組織、癌旁組織的陽性表達率明顯高于癌組織，這說明ING4蛋白表達水平的下降與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，也提示ING4蛋白在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用。

表1 ING4、p53、Ki-67蛋白表達與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關系(例)

p53作為抑癌基因在抑制腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。p53通過調(diào)節(jié)相關靶基因如p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIP1、PAG608、HER2、PCNA、cyclin G等從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡、細胞分化、DNA損傷、血管生成和轉(zhuǎn)移的抑制及其他功能[8]。許多實驗證實在不同惡性腫瘤中，p53與高級的病理分級、臨床分期、不良預后、復發(fā)、病死率均存在一定的相關性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤臨床分期、病理分級越高以及腫瘤個數(shù)的增多，p53蛋白陽性表達率越高。ING4基因能夠通過增強p53的作用從而起到激活細胞凋亡、影響細胞周期的作用，其機制可能是ING4蛋白的NLS轉(zhuǎn)錄的氨基酸蛋白能參與p53活化后的四聚化、細胞內(nèi)定位及調(diào)節(jié)p53蛋白轉(zhuǎn)錄，同時ING4的NLS區(qū)域能與p53結(jié)合，進而增強p53蛋白活性和提高p53的甲基化。

Ki-67是一種增殖相關性核抗原,在細胞周期中的G1、S、G2和M期中均有合成，其可準確反映細胞增殖狀況。一些研究報告提示，Ki-67的增殖系數(shù)能夠作為單獨因素來評估腫瘤的病理分級、臨床分期、預后、復發(fā)等，并且Ki-67在腫瘤中的過表達與腫瘤的侵襲性存在密切關系。本研究結(jié)果顯示，Ki-67蛋白隨著腫瘤臨床分期、病理分級越高以及腫瘤個數(shù)的增多，Ki-67蛋白陽性表達率增高。Nanding等[10]在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)，ING4蛋白隨著腫瘤的分級升高，其表達呈下降趨勢，并與Ki-67蛋白呈負相關，其結(jié)果顯示兩者與腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移及預后具有負相關性。本試驗中也觀察到ING4和Ki-67蛋白與腫瘤的病理分級或臨床分期有關，這表明ING4及Ki-67蛋白與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲性有關，但ING4與Ki-67蛋白之間的具體作用機制仍不清楚。

任何單一腫瘤標記物都不能全面準確地反映腫瘤的惡性潛能，更無法完全預測其預后。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因影響的復雜過程，聯(lián)合檢測ING4、p53及Ki-67可能對膀胱癌的早期診斷、精準治療及預測預后提供一定的幫助。本試驗結(jié)果顯示隨著腫瘤的病理分級或臨床分期升高，ING4與p53、Ki-67蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達呈負相關性，提示ING4基因在抑制膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，并且聯(lián)合檢測膀胱尿路上皮癌中ING4、p53及Ki-67蛋白表達有一定的臨床意義,這不但有利于揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移的機制, 也能作為評價患者預后的參考指標。

[1] Wang L, Feng C, Ding G, et al. Ki67 and TP53 expressions predict recurrence of non-muscle-invasive bladder cancer[J]. Tumour Biol, 2014,35(4):2989-2995.

[2] Liu W, Qi L, Zu X, et al. A preoperative marker panel for the prediction of residual tumor and the decision making for repeat transurethral resection[J]. Urol Oncol, 2015,33(4):165.e9-165.e14.

[3] Enache M, Simionescu C, Lascu LC. Ki67 and Bcl-2 immunoexpression in primitive urothelial bladder carcinoma[J]. Rom J Morphol Embryol, 2012,53(3):521-525.

[4] Shiseki M, Nagashima M, Pedeux RM, et al. p29ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300, and enhance p53 activity[J]. Cancer Res, 2003,63(10):2373-2378.

[5] Zhao D, Liu X, Zhang Y, et al. Reduced expression and prognostic implication of inhibitor of growth 4 in human osteosarcoma[J]. Oncol Lett, 2016,11(4):2869-2874.

[6] Nanding A, Tang L, Cai L, et al. Low ING4 protein expression detected by paraffin-section immunohistochemistry is associated with poor prognosis in untreated patients with gastrointestinal stromal tumors[J]. Gastric Cancer, 2014,17(1):87-96.

[7] Tapia C, Zlobec I, Schneider S, et al. Deletion of the inhibitor of growth 4 (ING4) tumor suppressor gene is prevalent in human epidermal growth factor 2 (HER2)-positive breast cancer[J]. Hum Pathol, 2011,42(7):983-990.

[8] Laptenko O, Prives C. Transcriptional regulation by p53: one protein, many possibilities[J]. Cell Death Differ, 2006,13(6):951-961.

[9] Proctor I, Stoeber K, Williams GH. Biomarkers in bladder cancer[J]. Histopathology, 2010,57(1):1-13.

[10] Nanding A, Tang L, Cai L, et al. Low ING4 protein expression detected by paraffin-section immunohistochemistry is associated with poor prognosis in untreated patients with gastrointestinal stromal tumors[J]. Gastric Cancer, 2014,17(1):87-96.

四川省教育廳科研項目(13EA0226)。

伍季(E-mail：wuji2168@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.017

R737.14

B

1002-266X(2016)45-0054-03

2016-08-12)