李顯輝

(天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170)

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丹參素對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

李顯輝

(天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170)

目的 探討丹參素對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 取指數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，隨機(jī)分為6組，A組使用10% FBS低糖(5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基，B組使用含10% FBS及高糖(30 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基，C、D、E、F組在B組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上分別加2、4、8、16 mg/L丹參素。培養(yǎng)20 h后采用CCK-8法檢測(cè)H9C2細(xì)胞的活力，培養(yǎng)18 h后采用生化法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的含量，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP1)及巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)的含量，培養(yǎng)18 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與A組比較，B組A450值明顯下降(P<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量增加，SOD、GSH-Px含量降低(P均<0.05)；H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平上升，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降(P均<0.05)。與B組比較，C、D、E、F組A450值升高(P均<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量低，SOD、GSH-Px含量高(P均<0.05)；H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平不同程度地降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平不同程度升高(P均<0.05)。結(jié)論 丹參素對(duì)于高糖環(huán)境下的H9C2細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制與減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，降低炎性因子和凋亡基因表達(dá)有關(guān)。

心肌細(xì)胞損傷；丹參素；炎癥反應(yīng)；細(xì)胞凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是持續(xù)性高血糖所引起的多系統(tǒng)組織器官損害而出現(xiàn)的主要并發(fā)癥。持續(xù)的高血糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷、慢性炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重塑、機(jī)械功能障礙、心肌電活動(dòng)異常，進(jìn)而出現(xiàn)心肌肥厚、心律失常，最終發(fā)生心力衰竭等臨床病癥[1～3]。因此，早期阻抑由高血糖引起的心肌損傷進(jìn)程對(duì)于DCM患者的預(yù)后至關(guān)重要。丹參素是活血化瘀類中藥丹參的主要水溶性成分之一，其通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、降低鈣離子超載等途徑保護(hù)心肌細(xì)胞[4～7]。然而，丹參素在高糖條件下能否發(fā)揮心肌保護(hù)作用尚不確定。2015年10月～2016年6月，本研究在體外建立高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型，觀察丹參素對(duì)高糖條件下心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9C2大鼠心肌細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫)，丹參素(中國(guó)食品藥品檢定研究院)，F(xiàn)BS(美國(guó)Hyclone公司)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，0.25%胰酶消化溶液(以色列Biological Industries公司)，葡萄糖(美國(guó)Amresco公司)，CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(日本同仁公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)生化檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，IL-6、IL-1β、TNF-α、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP1)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)，細(xì)胞總RNA提取試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒以及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、GAPDH基因驗(yàn)證型引物(廣州復(fù)能基因公司)。細(xì)胞觀察倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific Multiskan公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將H9C2細(xì)胞用含10% FBS的低糖(5 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基以2×107/L接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d后待細(xì)胞密度近90%時(shí)用0.25%胰酶溶液消化后傳代培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為6組:A組：使用10%FBS低糖(5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基；B組：使用含10% FBS及高糖(30 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基；C組：在高糖組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加2 mg/L丹參素；D組：在高糖組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加4 mg/L丹參素；E組：在高糖組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加8 mg/L丹參素；F組：在高糖組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加16 mg/L丹參素。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK法。取指數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞，用10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL細(xì)胞懸液加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔分別加入100 μL相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)18 h后每孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，孵育結(jié)束后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A450)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化應(yīng)激及炎癥因子檢測(cè) 取指數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞，用10% FBS低糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，按每孔500 μL細(xì)胞懸液加入至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔分別加入500 μL相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)18 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液于EP管中，將細(xì)胞培養(yǎng)液以12 000 r/min離心5 min后取上清液。按照生化檢測(cè)試劑盒操作要求檢測(cè)上清液中LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px含量。按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作要求檢測(cè)上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量。

1.5 H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取指數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞，用10% FBS低糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL細(xì)胞懸液加入至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔分別加入2 mL相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)18 h后收集H9C2細(xì)胞，按照各試劑盒要求提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后將cDNA及待測(cè)基因引物加入擴(kuò)增反應(yīng)體系中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。ΔCt值=樣本基因平均Ct值-相應(yīng)內(nèi)參基因平均Ct值；ΔΔCt值=每組ΔCt值-對(duì)照組ΔCt值；每組待測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)值=2-ΔΔCT，根據(jù)得出的該相對(duì)表達(dá)倍數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2細(xì)胞活力比較 與A組比較，B組A450值明顯下降(P<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組A450值升高(P均<0.05)，以E組為最高。見圖1。

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

圖1 6組H9C2細(xì)胞活力比較

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px含量比較 與A組比較，B組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、MDA含量增加，SOD、GSH-Px含量降低(P均<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、MDA含量低，SOD、GSH-Px含量高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px含量比較

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量比較 與A組比較，B組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量高(P均<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量低(P均<0.05)。見表2。

2.4 各組H9C2細(xì)胞凋亡因子mRNA相對(duì)表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，B組H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平上升，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降(P均<0.05)；與B組比較，C、D、E、F組H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平不同程度地降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平不同程度升高(P均<0.05)。見表3。

表2 各組H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF含量比較

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

表3 各組H9C2細(xì)胞凋亡因子mRNA相對(duì)表達(dá)比較

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

3 討論

DCM的病理過程是細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡壞死、炎癥反應(yīng)等諸多機(jī)制交互作用的復(fù)雜病理狀態(tài)[3]。持續(xù)高糖狀態(tài)刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而出現(xiàn)應(yīng)激損傷，大量活性氧物質(zhì)(ROS)的生成進(jìn)一步激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑；與此同時(shí)大量糖化終產(chǎn)物(AGEs)堆積促使心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)，進(jìn)而募集炎癥細(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)致心肌組織損傷壞死，最終致使心肌結(jié)構(gòu)各功能的破壞和失常。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞上清液LDH與CK水平明顯升高，表明H9C2細(xì)胞在高糖條件下出現(xiàn)了細(xì)胞膜的破壞；MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯降低，表明H9C2細(xì)胞在高糖條件下抗氧化能力降低，清除ROS的能力減弱，進(jìn)而出現(xiàn)了脂質(zhì)過氧化物導(dǎo)致細(xì)胞毒作用。H9C2細(xì)胞在高糖條件下炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP1、MIF大量表達(dá)，表明心肌細(xì)胞在高糖狀態(tài)下出現(xiàn)了早期的炎癥狀態(tài)，這種瀑布式的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步募集炎癥細(xì)胞進(jìn)入心肌組織加重心肌壞死。高糖條件下H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下降，說明Caspase信號(hào)級(jí)聯(lián)瀑布的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)被激活及線粒體膜破壞，出現(xiàn)了線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。該凋亡途徑一方面由ROS大量生成和AGEs堆積介導(dǎo)產(chǎn)生，另一方面也與炎性因子的刺激有關(guān)。本研究結(jié)果提示,不同濃度的丹參素在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等狀態(tài)激活方面的指標(biāo)表達(dá)均具有一定的反轉(zhuǎn)作用，說明丹參素通過如上幾條途徑對(duì)高糖條件下的心肌細(xì)胞發(fā)揮了保護(hù)性作用。糖尿病合并癥常涉及到視網(wǎng)膜病變、腎臟病變、神經(jīng)病變、心肌病變等諸多系統(tǒng)組織器官病變，涉及范圍十分廣泛遍及周身。糖尿病患者一旦出現(xiàn)并發(fā)癥僅僅通過調(diào)節(jié)血糖水平并不能完全阻抑受累組織器官的病變進(jìn)程。DCM患者的治療同樣在調(diào)控血糖的基礎(chǔ)治療之上應(yīng)當(dāng)重視心肌細(xì)胞的保護(hù)。本研究為DCM患者心肌保護(hù)的藥物治療策略提供了一定的參考。

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天津市衛(wèi)生局課題(07025)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.015

R363

A

1002-266X(2016)45-0048-03

2016-10-10)