王雪，楊偉，李靖，馬存花

(1勝利油田中心醫(yī)院，山東東營257000；2中國人民解放軍第89醫(yī)院；3濰坊醫(yī)學(xué)院)

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拉米夫定對人肝癌細(xì)胞MMP-9及p53蛋白表達(dá)的影響

王雪1，楊偉2，李靖2，馬存花3

(1勝利油田中心醫(yī)院，山東東營257000；2中國人民解放軍第89醫(yī)院；3濰坊醫(yī)學(xué)院)

目的 探討拉米夫定作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15后對細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)及p53蛋白表達(dá)的影響。方法 不同濃度(100、200、300 μg/mL)拉米夫定(拉米夫定100、200、300 μg/mL組)作用于HepG2.2.15細(xì)胞不同時(shí)間(3、6 d)，并設(shè)立不應(yīng)用拉米夫定的HepG2.2.15細(xì)胞作為對照組。MTT比色法測定細(xì)胞增殖活性；ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞中MMP-9及p53蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 拉米夫定100、200、300 μg/mL組與對照組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。作用3、6 d，與對照組比較，拉米夫定各處理組HepG2.2.15細(xì)胞及其培養(yǎng)液中MMP-9及p53蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)。結(jié)論 拉米夫定作用后HepG2.2.15細(xì)胞MMP-9及p53蛋白水平降低。

肝腫瘤；HepG2.2.15細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶9；p53蛋白；拉米夫定

肝癌(HCC)是臨床常見、惡性程度較高的腫瘤。在亞洲和非洲，HCC發(fā)病主要與感染乙肝病毒(HBV)有關(guān)[1]。HCC的特點(diǎn)是早期轉(zhuǎn)移，由腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中分泌的生物分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、p53，在其發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用。拉米夫定作為核苷類似物,可通過終止HBV DNA鏈合成抑制HCC發(fā)展[2]。2015年6月～2016年5月，本研究用拉米夫定作用于人HCC細(xì)胞系HepG2.2.15，對其細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9及p53蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，探討拉米夫定治療HCC的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人HCC細(xì)胞系HepG2.2.15(上海博谷生物科技有限公司)，α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)，G418(北京格林博遠(yuǎn)生物科技有限公司)，胰蛋白酶/EDTA、青鏈霉素混合液、PBS、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(北京Solarbio公司)，拉米夫定(葛蘭素史克公司)，MMP-9及p53試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 常規(guī)復(fù)蘇HepG2.2.15細(xì)胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、G418 200 μg/mL)，于5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。3～4 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至80%～90%融合度時(shí)使用胰蛋白酶/EDTA消化，按比例1∶3傳代。取對數(shù)期HepG2.2.15細(xì)胞，用胰蛋白酶/EDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按照104/孔接種于96孔板。設(shè)對照組(加細(xì)胞、培養(yǎng)基)和拉米夫定100、200、300 μg/mL組。拉米夫定100、200、300 μg/mL組添加不同濃度(100、200、300 μg/mL)拉米夫定200 μL。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖活力的檢測 采用MTT法。分別于拉米夫定干預(yù)后0、2、4、6、8 d采用MTT法測定每組細(xì)胞增殖情況。操作：吸棄上清，加入無血清培養(yǎng)基90 μL及MTT 10 μL，于5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)4 h。吸棄上清，每孔加入Formazan溶解液110 μL，振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔波長490 nm處吸光度(A)值，計(jì)算均值。

1.4 細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液中MMP-9、p53蛋白表達(dá)檢測 采用ELISA法。分別于拉米夫定干預(yù)后3、6 d收集細(xì)胞及其上清液。胰酶消化回收細(xì)胞，12 000 r/min離心5 min后棄上清液，加PBS 200 μL重懸。液氮 37 ℃水浴反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，重復(fù)3次。12 000 r/min離心10 min，留取上清液，-70 ℃凍存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書測定細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中MMP-9、p53蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力比較 拉米夫定100、200、300μg/mL組與對照組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹥0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力比較

2.2 各組細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液中MMP-9、p53蛋白表達(dá)比較 干預(yù)后第3、6天，與對照組比較，拉米夫定各處理組HepG2.2.15細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液中MMP-9、p53蛋白表達(dá)水平均降低(P均<0.05)。見表2、3。

表2 各組細(xì)胞及其上清液中MMP-9蛋白表達(dá)比較

注：與對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05。

表3 各組細(xì)胞及其上清液中p53蛋白表達(dá)比較

注：與對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05。

3 討論

VEGF可以增強(qiáng)細(xì)胞通透性，尤其是微小血管的通透性，引起血漿蛋白滲漏到細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞外基質(zhì)中沉著，為成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷入提供條件基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營養(yǎng)。MMP-9作為一種明膠酶，可以有效降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)系[3～5]。Riedel等[6]報(bào)道,MMP-9可作為腫瘤血管形成的調(diào)控因素參與腫瘤血管形成。其發(fā)揮作用時(shí)能在細(xì)胞表面激活MMP-2，并促進(jìn)MMPs家族其他因子的活化，共同發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[7,8]。在腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的轉(zhuǎn)移和浸潤過程中，MMP-9可通過刺激腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲，促進(jìn)血管生成而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起核心作用[9,10]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與HCC、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)[11,12]。此外，MMPs還可以增強(qiáng)血管生長因子的作用，促進(jìn)新生血管形成[13，14],已逐漸成為抗腫瘤治療中重要的藥物作用靶點(diǎn)。p53基因是目前研究較早的抑癌基因，分為突變型和野生型。野生型p53是抑癌基因，對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用。野生型p53突變后失去抑癌基因功能,并且與野生型p53結(jié)合成復(fù)合物，抑制p53基因功能,導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，可誘導(dǎo)一些異常基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生；可以下調(diào)抑制血管增生的凝血酶的反應(yīng)素-1和上調(diào)促血管增生的VEGF，因而成為調(diào)控腫瘤血管形成的重要因素。

HCC的特點(diǎn)是早期轉(zhuǎn)移，MMP-9及p53基因在其中起了關(guān)鍵作用。HBV是HCC公認(rèn)的致病因子，它在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制有可能激發(fā)p53，使其表達(dá)升高、功能增強(qiáng)，進(jìn)而可能導(dǎo)致細(xì)胞某些生物學(xué)活性(如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等)改變。有研究證實(shí)，p53失活與MMP-9的表達(dá)在HCC發(fā)展中起協(xié)同作用。Franchi等認(rèn)為，p53的突變可以上調(diào)MMP-9基因轉(zhuǎn)錄，并且通過NOS和EGFR途徑影響MMP-9的表達(dá)。本試驗(yàn)中，拉米夫定各處理組與對照組細(xì)胞增殖活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而拉米夫定各處理組細(xì)胞及上清液中p53及MMP-9蛋白的表達(dá)均降低，提示拉米夫定并不是通過直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來抑制腫瘤生長，而是通過某種機(jī)制導(dǎo)致p53、MMP-9的表達(dá)降低進(jìn)而抑制HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。試驗(yàn)結(jié)果提示：核苷類藥物不僅可以抑制HBV復(fù)制，還可能通過某種機(jī)制降低p53及MMP-9的表達(dá)，從而抑制HCC的發(fā)生和進(jìn)展。

[1] Lupberger J, Hildt E. Hepatitis B virus-induced oncogenesis[J].World J Gastroenterol， 2007，13 (1)：74-81.

[2] Dienstag JL, Schiff ER, Wright TL. Lamivudine as initial treatment for chronic hepatitis B in the United States[J]. N Engl J Med, 1999,341(17):1256.

[3] Raghu H, Sodadasu PK, Malla RR, et al. Localization of uPAR and MMP-9 in lipid rafts is critical for migration,invasion and angiogenesis in human breast cancer cells [J]. BMC Cancer, 2010,24(10):647.

[4] Canete A, Gerrard M, Rubie H, et al. Poor survival for infants with MYCN-amplified metastatic neuroblastoma despite intensified treatment: the International Society of Paediatric Oncology European Neuroblastoma Experience[J]. J Clin Oncol, 2009,27(7):1014-1019.

[5] Park JR, Eggert A, Caron H. Neuroblastoma: biology, prognosis and treatment[J]. Pediatr Clin North Am, 2008,55(1):97-103.

[6] Riedel F, Gotte K, Schwalb J, et al. Expression of 92 KD type Ⅳ collagenase correlates with angiogenic markers and poor survival in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2000,17(6):1099-1105.

[7] Zarrabi K, Dufour A, Li J, et al. Inhibition of matrix metalloproteinase 14(MMP-14)mediated cancer cell migration[J]. J Biol Chem, 2011,286(38):33167-33177.

[8] Koyama Y, Naruo H, Yoshitomi Y, et al. Matrix metalloproteinase-9 associated with heparan sulphate chains of GPI anchored cell surface proteoglycans mediates motility of murine colon adenocarcinoma cells[J]. J Biochem, 2008,143(5):581-592.

[9] Chen JS, Huang XH, Wang Q, et al. Sonic hedgehog signaling pathway induces cell migration and invasion through focal adhesion kinase/AKT signaling-mediated activation of matrix metallo proteinase(MMP)-2 and MMP-9 in liver Cancer[J]. Carcinogenesis, 2013,34(1):10-19.

[10] Cockrada AM, Medjkane S, Janski N, et al. SMYD3 promotes Cancer invasion by epigenetic upregulation of the metalloproteinase MMP-9[J]. Cancer Res, 2012,72 (3):810-820.

[11] Chetty C, Ponnala S, Gujrati M, et al. Knockdown of MMP-9 inhibits radiation-induced invasive phenoltype, angiogenesis and tum or growth in glioma cancer stem cell [J]. Cancer Res, 2013,73(8s):4907.

[12] 夏慶安，付玉環(huán)，姜廣建.HSG、MMP-9和MMP-2在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012,39 (2):323-324,327.

[13]Yu C, Pan K, Xing D, et al. Correlation between a single nucleotide polymorphism in the matrix metallopro teinase-2 promoter and risk of lung cancer[J]. Cancer Res, 2002,62(22):6430-6433.

[14] Huo N, Ichikawa Y, Kamiyama M, et al. MMP-7(matrilysin)accelerated growth of human umbilical vein endothelial cells[J]. Cancer Lett, 2002,177(1):95-100.

楊偉(E-mail:ywcyw723@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.013

R735.7

A

1002-266X(2016)45-0043-03

2015-09-28)