劉良忠,李小紅,馬樓艷,胡建蛾,張力,鄧超,李剛,張軍

(1重慶三峽中心醫(yī)院，重慶404000；2西安市第九醫(yī)院)

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·基礎研究·

白細胞介素37對食管癌細胞增殖、遷移、炎癥反應的影響及其機制

劉良忠1,李小紅1,馬樓艷2,胡建蛾1,張力1,鄧超1,李剛1,張軍1

(1重慶三峽中心醫(yī)院，重慶404000；2西安市第九醫(yī)院)

目的 探討白細胞介素37(IL-37)對食管癌細胞增殖、遷移、炎癥反應的影響及其可能的分子機制。方法 用不同濃度(0、10、50、100 ng/mL)的重組IL-37蛋白分別處理食管癌細胞Eca-109和TE-1 24、48、72 h，MTT法檢測其對細胞增殖率的影響；用100 ng/mL的重組人IL-37蛋白(IL-37組)干預兩種細胞株，對照組加入等量培養(yǎng)基，24 h后Transwell侵襲小室試驗檢測遷移細胞數目，流式細胞術檢測細胞凋亡率，RT-PCR檢測腫瘤壞死因子(TNF)α、IL-1β和IL-6的表達，Western blotting法檢測pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3的表達；兩種細胞株分別轉染pcDNA3.1空質粒(對照組)、pcDNA3.1-IL-6質粒(IL-6組)，IL-6+IL-37組轉染pcDNA3.1-IL-6質粒24 h后換含100 ng/mL重組人IL-37蛋白的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3的表達。結果 與其他濃度相比，100 ng/mL IL-37對細胞增殖具有明顯的抑制效果(P均<0.05)。Eca-109和TE-1細胞中，與對照組相比，IL-37組中的遷移數目均明顯減少，凋亡率均明顯增加(P均<0.05)。IL-37組中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA,pSTAT3 Y705、Bcl-2蛋白表達均降低(P均<0.05)，Caspase-3的表達增加(P均<0.05)。與對照組及IL-37+IL-6組比較，IL-6組pSTAT3Y 705和Bcl-2蛋白的表達增加，Caspase-3蛋白表達降低(P均<0.05)。結論 IL-37能夠抑制食管癌細胞的增殖、遷移及炎癥反應，并促進細胞凋亡，這些作用可能是通過IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮作用。

食管腫瘤；白細胞介素37；細胞增殖；炎癥；IL-6/STAT3信號通路

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤，盡管目前該疾病在治療方法上有了很大進展，但是仍有超過40%的食管癌患者術后出現復發(fā)[1]，因此迫切需要探索新的治療藥物。白細胞介素37(IL-37)是最新發(fā)現的IL-1家族的一員，是先天性免疫反應和獲得性免疫反應的抑制劑。已經發(fā)現，IL-37在結腸炎[2]、關節(jié)炎、銀屑病[3]等炎癥性疾病中表現出明顯的抗炎作用。近年研究發(fā)現，IL-37也具有明顯的抗腫瘤活性[4, 5]，但是IL-37在食管癌中的作用及機制還不清楚。2016年1月～2016年7月，本文進行了相關探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞株Eca-109和TE-1購自美國ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司，胰酶購自美國Gibco公司，MTT購自美國Sigma公司，AnnexinV: FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司，NanoFectin轉染試劑購自上海依科賽生物制品有限公司，RNAisoPlus試劑購自大連寶生物公司，SYBR RT-PCR試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，RIPA裂解液、PMSF和結晶紫染色液購自上海碧云天生物技術有限公司，重組人IL-37蛋白購自美國R&D公司，BCA法蛋白定量試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，Anti-信號轉導子與轉錄活化子3 (STAT3) (phospho Y705)抗體(1∶200 000)、Anti-Bcl-2抗體(1∶1 000)和Anti-active Caspase-3抗體(1∶500)購自英國Abcam公司。Anti-β-actin抗體和Goat Anti-rat IgG/HRP抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理 Eca-109和TE-1細胞均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，待細胞長至90%左右時胰酶消化傳代。首先用不同濃度(0、10、50、100 ng/mL)的重組人IL-37蛋白處理兩種細胞，檢測其對細胞增殖活力的影響。將部分細胞隨機分成對照組和IL-37組，IL-37組用指定濃度的重組人IL-37蛋白處理，對照組加入等量的培養(yǎng)基，檢測IL-37對細胞遷移、凋亡和炎性細胞因子表達的影響。將另一部分細胞隨機分成對照組、IL-6組和IL-37+IL-6組，Eca-109和TE-1細胞接種到6孔板中，待細胞融合度達到60%左右時，對照組轉染pcDNA3.1空質粒；IL-6組及IL-37+IL-6組用NanoFectin轉染試劑轉染pcDNA3.1-IL-6質粒；轉染24 h，IL-37+IL-6組換成含有100 ng/mL重組人IL-37蛋白的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測各組中相關蛋白表達情況。

1.3 食管癌細胞增殖活力的測算 采用MTT法。取對數生長期Eca-109和TE-1細胞，按照1×103/孔的密度分別接種于96孔板中，加入不同濃度(0、10、50、100 ng/mL)的重組人IL-37蛋白分別培養(yǎng)24、48、72 h后，換成含有500 μg/mL MTT的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄上清，加入異丙醇溶解甲臜晶體，然后在570 nm條件下測定吸光值。

1.4 食管癌細胞遷移能力的檢測 采用Transwell侵襲小室試驗。將Transwell小室放入24孔板中，上室加入100 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，含2×105個細胞；下室加入600 μL含有100 ng/mL重組人IL-37蛋白的完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，倒掉小室中的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS漂洗3遍，顯微鏡下隨機選取6個視野進行計數，計算每個視野中平均遷移細胞數目。

1.5 食管癌細胞凋亡率的檢測 使用流式細胞術。將兩種食管癌細胞按照1×106/孔的密度分別接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后，換成含有100 ng/mL重組人IL-37蛋白的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，按照AnnexinV:FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書操作，在FACSCalibur流式細胞儀上檢測凋亡細胞。計算細胞凋亡率。

1.6 食管癌細胞中腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相對表達量檢測 采用RT-PCR法。按照RNAisoPlus說明書操作，提取細胞總RNA。取2 μg總RNA進行逆轉錄，然后按照RT-PCR試劑盒說明書操作，以β-actin為內參，按照2-ΔΔCt的方法計算細胞中 TNF-α、IL-1β和IL-6的相對表達量。引物序列：IL-1β上游5′TATAGCCTGGACTTTCCTGTT3′，下游5′GCTGACTGTCCTGGCTGATG3′；IL-6：上游5′CCTCCAGAACAGATTTGAG3′，下游5′ATTTGTGGTTGGGTCAGG3′；TNF-α：上游5′GCCGCATCGCCGTCTCCTAC3′，下游5′CCTCAGCCCCCTCTGGGGTC3′；β-actin：上游5′GCAAATGCTTCTAGGCGGAC3′，下游5′GCTGTCACCTTCACCGTTCC3′。

1.7 IL-37及IL-6對Eca-109和TE-1細胞中pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 采用Western blotting法。細胞用冰冷的無菌PBS清洗2遍，加入100 μL RIPA裂解液(含10 mmol/L PMSF)充分裂解細胞，4 ℃、12 000 g離心15 min收集上清液，即為總蛋白。BCA法測定總蛋白的濃度后，每孔取總蛋白40 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入提前稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次，加ECL發(fā)光液，充分覆蓋膜后拍照并進行灰度值分析。

2 結果

2.1 不同時間不同濃度IL-37對食管癌細胞增殖活力的影響 重組IL-37蛋白以時間劑量依賴的方式抑制Eca-109和TE-1細胞的生長(P均<0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05。

圖1 不同濃度的IL-37對Eca-109和TE-1細胞增殖的影響

2.2 IL-37對食管癌細胞遷移力及細胞凋亡率的影響 Eca-109細胞中,對照組、IL-37組細胞遷移數分別為119.83±6.24、44.00±4.94個/視野，凋亡率分別為8.29%±0.85%、35.44%±2.97%；TE-1細胞中分別為 151.50±9.38、31.83±8.26個/視野，3.16%±0.98%、45.26%±3.21%。與對照組相比，Eca-109和TE-1細胞IL-37組中的遷移數目均明顯減少，凋亡率均明顯升高(P均<0.05)。

2.3 IL-37對Eca-109和TE-1細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結果見圖2。與對照組相比，兩種細胞IL-37組中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達均明顯降低(P<0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05。

圖2 IL-37對Eca-109和TE-1細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響

2.4 IL-37對Eca-109和TE-1細胞中pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 Eca-109細胞中，對照組、IL-37組pSTAT3 Y705、Bcl-2、Caspase-3相對表達量分別為0.68±0.14、0.49±0.07、0.02±0.01，0.11±0.05、0.19±0.06、0.83±0.07；TE-1細胞中分別為0.74±0.05、0.54±0.07、0.04±0.05，0.26±0.03、0.30±0.04、1.25±0.07。Eca-109和TE-1細胞中，與對照組比較，IL-37組pSTAT3 Y705與Bcl-2的表達均降低，Caspase-3的表達增加(P均<0.05)。

2.5 IL-37及IL-6對Eca-109和TE-1細胞中pSTAT3 Y705、Bcl-2 和Caspase-3蛋白表達的影響 Eca-109細胞中，對照組pSTAT3 Y705、Bcl-2、Caspase-3分別為0.56±0.07、0.37±0.09、0.12±0.04，IL-6組分別為1.55±0.13、1.61±0.16、0.02±0.02，IL-37+IL-6組分別為0.82±0.65、0.56±0.07、0.15±0.03。與對照組及IL-37+IL-6組比較，IL-6組pSTAT3Y 705和Bcl-2的表達增加，Caspase-3表達降低(P均<0.05)；TE-1細胞中，對照組pSTAT3 Y705、Bcl-2、Caspase-3分別為0.77±0.08、0.64±0.07、0.17±0.05，IL-6組分別為1.47±0.09、1.33±0.08、0.05±0.03，IL-37+IL-6組分別為0.91±0.05、1.02±0.10、0.25±0.07。與對照組及IL-37+IL-6組比較，IL-6組pSTAT3Y 705和Bcl-2蛋白的表達增加，Caspase-3蛋白表達降低(P均<0.05)。

3 討論

IL-37被認為是先天性免疫反應的天然抑制劑，炎性組織中高表達的IL-37可抑制過多的炎癥反應[5]。近年IL-37的抗腫瘤活性也逐漸被發(fā)現。研究顯示，瘤內注射腺病毒介導的IL-37能夠抑制小鼠肺纖維瘤生長[6]。IL-37還可以抑制肝癌、腎癌[4]、宮頸癌[7]和非小細胞肺癌等癌癥進程，但是IL-37在食管癌中的作用還不清楚。

本研究結果顯示，IL-37能夠抑制食管癌細胞Eca-109和TE-1的增殖，并且具有劑量依賴性，同時IL-37還可以抑制兩種細胞遷移，并促進細胞凋亡。腫瘤相關性炎癥被認為是腫瘤的第七個特征，在腫瘤微環(huán)境中，過多的炎癥能夠促進腫瘤細胞增殖、血管生成、細胞轉移,破壞獲得性免疫反應，還可以減少細胞對激素和化學治療藥物的反應[8]。細胞因子在炎癥過程中發(fā)揮著重要作用，因此我們探究了IL-37對細胞因子表達的影響。TNF-α是與炎癥和免疫密切相關的一個細胞因子，它能夠促進腫瘤的生長和轉移，從而加速腫瘤形成[9]。IL-1β在包括食管癌在內的多種腫瘤中的表達增加，它能夠促進腫瘤的增殖、轉移和藥物耐受[10]。IL-6是參與炎癥相關腫瘤形成中的一個主要促炎因子，在食管癌中它與血管生成、上皮細胞間質化和不良預后有關。Leu等[11]的研究還發(fā)現IL-6能夠抑制星孢菌素誘導的食管癌細胞凋亡。本研究結果顯示，重組IL-37蛋白能夠降低Eca-109和TE-1食管癌細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，這表明IL-37能夠抑制食管癌細胞的炎癥反應。

STAT3是STAT家族的一個重要成員，酪氨酸磷酸化激活后形成二聚體，易位到核內，識別STAT3特異性DNA結合位點，轉錄激活靶基因。STAT3在人類多種腫瘤中處于活化狀態(tài)，活化的STAT3與腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲,血管生成和轉移有關。本研究發(fā)現，IL-37能夠降低食管癌細胞pSTAT3 Y705的表達。這表明IL-37可能是通過IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮作用的。我們通過瞬時轉染pcDNA3.1-IL-6使IL-6過表達，然后加入重組IL-37蛋白，驗證IL-37是否是通過該信號通路起作用的。結果發(fā)現，過表達IL-6導致pSTAT3 Y705、Bcl-2表達增加，Caspase-3表達降低。Bcl-2是一個重要的抗凋亡因子，在腫瘤細胞的抗凋亡機制中具有關鍵作用；活化的Caspase-3能夠促進細胞凋亡。過表達IL-6后，Bcl-2表達增加及Caspase-3表達減少也進一步驗證了IL-6的抗凋亡作用。加入重組IL-37蛋白后降低了IL-6過表達誘導的pSTAT3 Y705、Bcl-2的表達，增加了Caspase-3的活化，這表明IL-37在食管癌細胞中是通過IL-6/STAT3發(fā)揮作用的。另外，IL-37還可以下調IL-6誘導的TNF-α和IL-1β的表達，這表明IL-37對炎癥的抑制作用也與IL-6/STAT3信號通路有關。

總之，IL-37能夠抑制食管癌細胞的增殖、遷移和炎癥反應，而且還可以誘導其凋亡，這些作用可能是通過抑制IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮作用的。這為臨床上食管癌的治療提供了一定的理論基礎和新的治療方向。但是本研究僅在體外探究了IL-37對食管癌細胞的作用，它在體內對食管癌的作用仍需進一步探究。

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重慶市萬州區(qū)科委項目(201203051)。

張軍(E-mail:cbaoqing@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.010

R735.1

A

1002-266X(2016)45-0034-04

2016-05-28)