魏堯悅，侯琳

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山東青島 266021)

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2,3-吲哚醌對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制

魏堯悅，侯琳

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山東青島 266021)

目的 探討2,3-吲哚醌對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，用不同濃度(50、100、200、300 μmol/L)的2,3-吲哚醌處理細(xì)胞48 h, 并設(shè)不加藥物處理的細(xì)胞作為對照組，CCK-8法檢測細(xì)胞活性，篩選合適的2,3-吲哚醌濃度；用吖啶橙染色法檢測對照組和 200 μmol/L 2,3-吲哚醌處理組(加藥組)的自噬溶酶體細(xì)胞數(shù)量；將細(xì)胞分別用50、100、200、300 μmol/L 2,3-吲哚醌處理(加藥組)，并設(shè)空白對照,48 h后用Western blotting法檢測自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平,Transwell小室試驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力，劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果 與對照組相比，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，細(xì)胞A450值降低，藥物對細(xì)胞的抑制率升高(P<0.05或<0.01)。吖啶橙染色結(jié)果顯示，與對照組相比，加藥組產(chǎn)生自噬溶酶體的細(xì)胞數(shù)增多(P<0.01)。Western blotting結(jié)果顯示，與空白對照比較，隨著藥物濃度增加，加藥組LC3-Ⅱ表達(dá)增多(P<0.05或<0.01);Transwell小室試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)表明，隨著2,3-吲哚醌濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力逐漸減弱(P均<0.05)。結(jié)論 2,3-吲哚醌可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y自噬,從而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤；SH-SY5Y細(xì)胞；2,3-吲哚醌；侵襲；轉(zhuǎn)移

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見實(shí)體瘤，近50%發(fā)生在一歲左右的嬰幼兒[1]，其起源于胚胎期交感神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)嵴細(xì)胞，是小兒癌癥死亡的首要原因，占所有兒童癌癥病死率的13%[2]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的最顯著特點(diǎn)是其臨床異質(zhì)性，約有一半的病例被列為高風(fēng)險(xiǎn)，盡管使用多種方法治療仍然只有40%左右的生存率[1]。2,3-吲哚醌不僅作為一種海洋活性藥物發(fā)揮抗癌作用，而且是人體內(nèi)源性物質(zhì)，其具有多種藥理學(xué)活性，如保護(hù)神經(jīng)、抗菌、抗病毒等[3]。研究表明，2,3-吲哚醌可以抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)[4]，但未見有關(guān)2,3-吲哚醌對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬及侵襲轉(zhuǎn)移影響的報(bào)道。2015年9月～2016年7月，我們觀察了2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細(xì)胞自噬及侵襲轉(zhuǎn)移的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y(購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫)。試劑與儀器：2,3-吲哚醌(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；Gibco胎牛血清(青島浩賽科技有限公司)；青鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司)；甘氨酸、Tris堿、牛血清白蛋白(BSA)(上海生工生物工程有限公司)；6×Protein Loading Buffer(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Tris 8.8緩沖液、Tris 6.8緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、過硫酸銨(Sigma公司)；苯甲基磺酰氟(武漢博士德生物工程有限公司)；Protein Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(MILLIPORE公司)；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人LC3B單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；垂直電泳儀、濕法轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；發(fā)光呈像系統(tǒng)(型號Fusion FX7)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、96孔板(Thermo Fisher公司)；吖啶橙(AO)(Sigma公司)；Transwell小室(Corning公司)；Matrigel基質(zhì)膠(BD公司)；超凈工作臺(蘇凈安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；超速離心機(jī)(Eppendorf公司)；pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)。

1.2 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y體外培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 μg/mL)，37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下，使用培養(yǎng)皿連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.3 不同濃度2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細(xì)胞抑制率影響的檢測 采用CCK-8法。取大約90%融合的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，吹打均勻，調(diào)整密度，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，接種到96孔板。設(shè)置5個復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁，進(jìn)入對數(shù)生長期后，更換新的血清濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基，并加入2,3-吲哚醌至終濃度50、100、200、300 μmol/L,對照組不加藥物處理。作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱孵育2 h。450 nm測定吸光度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 2,3-吲哚醌處理后SH-SY5Y細(xì)胞自噬溶酶體的檢測 采用AO染色法。取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于6孔板，24 h后加200 μmol/L 2,3-吲哚醌(加藥組)處理，對照組不做藥物處理，作用48 h后，把藥物處理好的細(xì)胞用PBS清洗2次，用0.25%的胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心3 min后棄上清，加PBS把細(xì)胞調(diào)至1×105～10×105/mL吹打混勻，取300 μL吸到EP管中，加入AO 3 μL，37 ℃避光孵育15 min。加PBS 0.5 mL,1 500 r/min、4 ℃、離心5 min，收集細(xì)胞，棄上清。然后用PBS 1 mL 把細(xì)胞沉淀打散，同樣條件離心，去PBS,再加PBS 1 mL洗2次。最后一次離心后，留下少量液體約10 μL滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片在熒光倒置顯微鏡上(放大倍數(shù)20倍藍(lán)光激發(fā))觀察拍照。熒光顯微鏡下觀察到的橘紅色點(diǎn)狀體即自噬囊泡。

1.5 SH-SY5Y細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)的檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)期生長細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加2,3-吲哚醌(藥物濃度分別為100、200、300 μmol/L)處理48 h，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，8%分離膠和10%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，加β-actin和LC3B一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。然后用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，再次用1×TBST洗膜10 min，重復(fù)3次。最后將ECL發(fā)光液按說明書加到PVDF膜上，室溫放置1 min，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比較目的蛋白的表達(dá)。

1.6 SH-SY5Y細(xì)胞侵襲能力的檢測 采用Transwell小室試驗(yàn)。將Matrigel 基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液按1∶6 配制后每孔50 μL加入Transwell 小室，放入CO2培養(yǎng)箱中1 h使基質(zhì)膠凝固。吸出Transwell 小室中未凝固的培養(yǎng)基，加入50 μL 含10 mg/mL BSA 的無血清培養(yǎng)液，37 ℃、30 min。取對數(shù)期生長細(xì)胞加2,3-吲哚醌處理(藥物濃度分別為100、200、300 μmol/L)，消化細(xì)胞，配成細(xì)胞懸液；每孔上室加入 200 μL細(xì)胞懸液和2,3-吲哚醌；下腔室中加入 600 μL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基后放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中，孵育24 h。對照組加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取出 Transwell小室 用 PBS 洗 2 遍， 5%甲醛固定， 再用PBS 洗 2 遍，加入0.1%結(jié)晶紫染色，室溫 0.5 h ， PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.7 SH-SY5Y細(xì)胞遷移能力的檢測 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。將細(xì)胞接種于6 孔板,待細(xì)胞貼壁后,用1 000 μL 規(guī)格的槍頭在孔板底部劃十字,用PBS洗凈刮下的細(xì)胞, 換上新的培養(yǎng)基后加入濃度梯度分別為100、200、300 μmol/L的2,3-吲哚醌處理，并設(shè)空白對照，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別觀察12、24、48 h同一視野下劃痕處細(xì)胞遷移的距離并拍照對比分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細(xì)胞抑制率的影響 對照組及2,3-吲哚醌濃度為50、100、200、300μmol/L時，細(xì)胞A450值分別為1.610±0.050、 1.580±0.031、1.540±0.045、1.443±0.094、1.242±0.053，細(xì)胞抑制率分別為0、5.370%±0.431%、21.160%±1.738%、32.280%±0.924%、55.740%±1.708%。與對照組比較，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，A450值降低，藥物對細(xì)胞的抑制率升高(P<0.05或<0.01)。

2.2 2,3-吲哚醌對SH-SY5Y細(xì)胞自噬溶酶體形成的影響 200μmol/L2,3-吲哚醌處理SH-SY5Y細(xì)胞48h,AO染色后可見經(jīng)2,3-吲哚醌處理的SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)較多的紅色點(diǎn)狀聚集。加藥組及對照組的自噬細(xì)胞陽性率分別為81.397%±3.856%、13.333%±1.528%，兩者比較，P<0.01。

2.3 不同濃度2,3-吲哚醌處理后LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá) 空白對照及100、200、300μmol/L2,3-吲哚醌處理48h后SH-SY5Y細(xì)胞LC3-Ⅱ水平分別為0.17±0.04、0.41±0.11、0.59±0.26、0.78±0.19，與空白對照比較，隨著2,3-吲哚醌濃度升高，SH-SY5Y細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.05或<0.01)。

2.4 不同濃度2,3-吲哚醌對細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對照及100、200、300μmol/L2,3-吲哚醌處理48h后發(fā)生侵襲的SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)分別為(327.33±26.63)、(185.67±11.24)、(147.33±2.52)、(75.33±6.03)個，SH-SY5Y細(xì)胞抑制率分別為0、43.11%±4.37%、54.80%±3.59%、76.99%±0.23%，與空白對照相比，不同濃度2,3-吲哚醌(100、200、300μmol/L)穿過Matrigel基質(zhì)小室的SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)量隨藥物濃度的升高而減少，細(xì)胞抑制率升高(P均<0.01)。

2.5 不同濃度2,3-吲哚醌對細(xì)胞遷移能力的影響 與對照相比，同一作用時間下，隨著2,3-吲哚醌濃度的升高，細(xì)胞遷移能力減弱(P均<0.05)；隨著作用時間的延長(12、24、48h)，同一濃度下，2,3-吲哚醌對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖1)。

注：與空白對照同時點(diǎn)比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 2,3-吲哚醌對細(xì)胞遷移的抑制作用

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征,也是影響治療結(jié)果和預(yù)后的重要因素[5]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度高，預(yù)后差，不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差別很大。大多數(shù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者死亡的主要原因是淋巴轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移[6,7]，因此抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是其治療的關(guān)鍵。2,3-吲哚醌毒性低、不良作用小。諸多研究表明，2,3-吲哚醌可以抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等[8～10]。本試驗(yàn)通過Transwell小室試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)分別檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力,結(jié)果提示，2,3-吲哚醌能顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，且抑制能力隨藥物濃度的升高和作用時間的增加而增強(qiáng)。

自噬是真核細(xì)胞普遍存在的一種現(xiàn)象，是細(xì)胞受到外界或內(nèi)在刺激發(fā)生的一種應(yīng)激反應(yīng)，是細(xì)胞用來達(dá)到動態(tài)平衡的重要機(jī)制之一[11]。自噬在腫瘤形成和發(fā)展中扮演抑制和促進(jìn)的雙重角色；自噬一方面通過質(zhì)量控制功能抑制慢性組織損傷和炎性反應(yīng)以及維持基因穩(wěn)定來抑制腫瘤，另一方面通過營養(yǎng)回收維持腫瘤生長代謝從而促進(jìn)腫瘤存活[12]。雖然自噬對腫瘤發(fā)生發(fā)展具有雙重作用, 但由于多數(shù)腫瘤細(xì)胞自噬能力降低,因此,自噬的缺陷可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制, 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡是治療腫瘤的潛在途徑[11]。 LC3 是哺乳動物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，有兩種形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ， LC3-Ⅰ在細(xì)胞內(nèi)，而LC3-Ⅱ與細(xì)胞膜結(jié)合。LC3-Ⅰ是新合成的pre-LC3經(jīng)過剪切修飾除去C末端22個氨基酸構(gòu)成的，隨后LC3-Ⅰ的一小部分轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ。因此，LC3-Ⅱ的表達(dá)量與自噬程度相關(guān)[13]。本試驗(yàn)通過AO染色和Western blotting法分別在細(xì)胞水平和蛋白水平檢測2,3-吲哚醌對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬作用的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，加藥組產(chǎn)生自噬溶酶體的細(xì)胞數(shù)顯著增多；Western blotting結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)量顯著增多，提示2,3-吲哚醌能促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬。

綜上所述，2,3-吲哚醌可能通過促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬來抑制其侵襲轉(zhuǎn)移。然而，自噬和侵襲轉(zhuǎn)移是非常復(fù)雜的過程，2,3-吲哚醌對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬的具體機(jī)制以及其與侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，仍待進(jìn)一步研究。

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Effect of 2,3-isatin on invasion and metastasis of neuroblastoma SH-SY5Y cells and its mechanism

WEIYaoyue,HOULin

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Objective To investigate the effect of 2,3-isatin on the invasion and metastasis of neuroblastoma SH-SY5Y cells and the mechanism. Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro were treated for 48 h with different concentrations of 2,3-isatin (25, 50, 100, 200 and 300 μmol/L). The cell viability was measured by CCK-8. The number of cells with autolysosome in the control group and 200 μmol/L isatin-treated group was detected by acridine orange staining fluorescence. The expression of LC3 Ⅱ, a marker protein for autophagy was examined by Western blotting. The invasion of SH-SY5Y cells was tested by Transwell assay and the motile ability was detected by Scratch test.Results Compared with the control group, the A450 value decreased and the inhibition rate increased when the concentration of 2,3-isatin was higher than 100 μmol/L (P<0.05 orP<0.01). AO staining showed that the number of autolysosomes increased in the 200 μmol/L 2,3-isatin treatment group as compared with that of the control group (P<0.01). Western blotting showed that the expression of LC3-Ⅱincreased with the increasing drug concentration (P<0.05). Transwell assay and Scratch test showed that the invasion and motile abilities of SH-SY5Y cells diminished with the increasing concentration of 2,3-isatin (allP<0.05). Conclusion 2,3-isatin may inhibit the invasion and metastasis of SH-SY5Y cells by inducing the autophagy.

neuroblastoma; SH-SY5Y cells; 2,3-isatin; invasion; metastasis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 81472542)。

魏堯悅(1990- )，女，碩士，主要研究方向?yàn)榭鼓[瘤藥物。E-mail:hanyue810713791@163.com

侯琳(1962- )，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤分子生物學(xué)。E-mail：qingdaodxyy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.007

R739.4

A

1002-266X(2016)45-0023-04

2016-08-19)