田雪，張杏怡，李鋒，肖輝，周新

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海200080)

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慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織JNK/SAPK水平變化及意義

田雪，張杏怡，李鋒，肖輝，周新

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海200080)

目的 探討C-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織中的水平變化及意義。方法 16只Ⅱ級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和COPD組。對(duì)照組不予任何處理，COPD組給予煙熏刺激，造成大鼠COPD動(dòng)物模型。造模成功后，光鏡下觀察肺組織病理，動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)肺功能，ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織TNF-α水平，免疫組化法檢測(cè)肺組織JNK/SAPK表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肺組織JNK/SAPK mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 COPD組光鏡下出現(xiàn)了大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡融合，肺泡數(shù)量減少，證明COPD造模成功。與對(duì)照組比較，COPD組第0.3秒用力呼氣容積與用力呼氣容積的比值降低，呼氣阻力、吸氣阻力升高，動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降(P<0.05或<0.01)，TNF-α升高(P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示，COPD組肺組織中JNK/SAPK蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COPD組JNK/SAPK mRNA水平升高(P均<0.05)。JNK/SAPK mRNA表達(dá)水平與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.751,P<0.05)。結(jié)論 煙霧誘導(dǎo)的COPD大鼠JNK/SAPK水平升高，其可能通過(guò)激活煙霧誘導(dǎo)的炎癥因子，導(dǎo)致氣道炎癥和肺氣腫,促進(jìn)COPD發(fā)生。

慢性阻塞性肺疾病；C-Jun氨基末端蛋白激酶；應(yīng)激激活蛋白激酶；作用機(jī)制

C-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，為哺乳動(dòng)物絲裂素活化蛋白激酶家族中的一員。胞外多種刺激信號(hào)，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、環(huán)境應(yīng)激，促使JNK/SAPK磷酸化，使其從細(xì)胞質(zhì)中移位到細(xì)胞核，與其下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、ATF2或c-Jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子的活性區(qū)域發(fā)生磷酸化，促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)，提高核轉(zhuǎn)錄能力，介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、基因轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[1]。JNK/SAPK被激活后，能通過(guò)不同的下游分子調(diào)控機(jī)體和細(xì)胞的各種功能，如mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、線粒體功能等，其中很重要的一項(xiàng)功能是調(diào)控細(xì)胞自噬[2,3]。目前，在腫瘤[4]、肥胖和糖尿病[5]、神經(jīng)退行性疾病[6]以及衰老[7]等疾病過(guò)程中可見(jiàn)JNK/SAPK作用的相關(guān)研究，然而關(guān)于JNK/SAPK在各種呼吸系統(tǒng)疾病中作用的研究非常少。在呼吸系統(tǒng)疾病中，有文獻(xiàn)報(bào)道，吸入含鹽酸的胃液可通過(guò)調(diào)控JNK/SAPK和ERK1/2從而阻止TNF-α受體基因轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)急性上呼吸道感染[8]。另有研究報(bào)道，結(jié)核桿菌通過(guò)調(diào)控JNK/SAPK和p38信號(hào)通路共同介導(dǎo)PI3K/PDK1/AKT信號(hào)通路，從而提高細(xì)胞趨化因子Leukotactin-1表達(dá)，加速肺結(jié)核形成[9]。除此之外，臨床研究報(bào)道，JNK/SAPK信號(hào)通路在呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病中起了至關(guān)重要作用[10]。然而其對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)的影響尚未明確。2015年5月～2016年3月，本研究構(gòu)建大鼠COPD模型，采集肺組織標(biāo)本，觀察COPD大鼠肺組織JNK/SAPK表達(dá)變化，分析JNK/SAPK與COPD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 Ⅱ級(jí)Wistar雄性大鼠16只，6～7周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。鼠代謝籠(L2890339，西域機(jī)電系統(tǒng)有限公司)；勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司，型號(hào)：T25 basic)；Buxco PFT系統(tǒng)肺功能檢測(cè)儀(美國(guó)BUXCO公司)；臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf 公司)；戊巴比妥鈉進(jìn)口分裝(上海國(guó)藥集團(tuán))；脂多糖(美國(guó)Sigma公司)；一抗JNK/SAPK試劑盒和二抗(上海寶曼生物科技有限公司)；TRIzol試劑(上海生工生物工程公司)；RNA分離純化試劑盒(加拿大BBI公司)。

1.2 分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和COPD組，各8只。對(duì)照組不予任何處理。COPD組采用煙霧熏吸法。將大鼠放入自制的有機(jī)玻璃染毒箱(100 cm×80 cm×50 cm)內(nèi)，香煙點(diǎn)燃后，用60 mL注射器吸滿煙霧，然后通過(guò)三通管將香煙煙霧快速注入染毒箱內(nèi)。為減少香煙燃燒所產(chǎn)的水蒸氣對(duì)大鼠的影響，在箱底放置適量硅膠干燥劑。每次持續(xù)時(shí)間大約1 h、間隔4 h一次，共28 d，同時(shí)第1、14天給予氣管內(nèi)注入脂多糖。

1.3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 28 d后處死大鼠，暴露肺部，取部分左肺及氣管支氣管置于10%甲醛溶液中充分固定48 h。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟(時(shí)間>3 h)，包埋，每一組織塊行厚4 μm連續(xù)切片兩張，常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下攝片觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4 肺功能的測(cè)定 將大鼠以4%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，縱行切開(kāi)頸部皮膚約2 cm，機(jī)械鈍性分離皮下組織，暴露并分離氣管后，在第三、四氣管環(huán)中間切開(kāi)倒“T”型切口，將氣管插管插入氣管中，并用線系緊。動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)調(diào)試后，將大鼠放入體描箱，將氣管插管與體描箱氣路相連。設(shè)定呼吸機(jī)參數(shù)：呼吸比15∶10，呼吸頻率75次/min。調(diào)整流量閥，使動(dòng)物的潮氣量為5 mL/kg。從氣道壓力曲線上觀察動(dòng)物是否有呼吸對(duì)抗。如有呼吸對(duì)抗，則逐次按50 mg/kg劑量追加麻醉，直至對(duì)抗消失。呼吸對(duì)抗消失后，關(guān)閉體描箱，點(diǎn)擊“開(kāi)始”按鈕，開(kāi)始測(cè)定肺功能，采集數(shù)據(jù)。

1.5 大鼠肺組織中TNF-α水平檢測(cè) 采用ELISA法。暴露肺部，取部分左肺組織，加入生理鹽水，勻漿。用大鼠TNF-α單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的TNF-α與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠TNF-α形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)A值，TNF-α水平與A值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TNF-α水平。

1.6 肺組織JNK/SAPK蛋白相對(duì)表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化法。取部分右肺組織樣本浸泡于4%多聚甲醛中固定、包蠟、切片(厚度為4 μm),貼片于載玻片，60 ℃烤片，存于通風(fēng)處。免疫組化法順序如下：脫蠟，抗原修復(fù)，加入一抗(靶蛋白)，4 ℃過(guò)夜；次日，加入二抗、HRP生物標(biāo)志鏈，DAB顯色，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗泛藍(lán)20 min，常規(guī)脫水、透明、封片。采用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，鏡下觀察到棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片取10個(gè)高倍鏡視野，以陽(yáng)性細(xì)胞的積分吸光度(IA)為判定指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 肺組織JNK/SAPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。取部分右肺組織，以高速勻漿機(jī)制備組織勻漿。以TRIzol試劑進(jìn)行總RNA提取，以O(shè)ligo DT為引物從總RNA中合成cDNA，然后用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)JNK/SAPK mRNA表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。JNK上游引物： 5′GGTATGCCCAAGAGGACAGAGGA3′，下游引物：5′AGCCCAGATAGAGCCAGTCGTAA3′，產(chǎn)物228 bp。GAPDH 上游引物：5′CCTTCCGTGTTCCTACCCCC3′，下游引物：5′AGCCCAAGATGCCCTTCAGT 3′，產(chǎn)物481 bp。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY軟件分別測(cè)量?jī)?nèi)參和JNK/SAPK mRNA基因擴(kuò)增條帶的密度，以JNK/SAPK mRNA條帶的密度與內(nèi)參基因的密度比值代表基因表達(dá)的相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺組織病理表現(xiàn) 對(duì)照組(圖1A)肺組織無(wú)明顯變化；COPD組(圖1B)小氣道上皮細(xì)胞變性壞死糜爛脫落，氣道黏膜充血水腫，同時(shí)管腔內(nèi)可見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞聚集和炎性滲出物，氣管、支氣管周?chē)罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，管腔變小、狹窄，肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴(kuò)大，部分肺泡出現(xiàn)融合現(xiàn)象。肺泡數(shù)量減少，肺泡毛細(xì)血管床減少，以上表現(xiàn)均與COPD的病理改變一致，說(shuō)明造模成功(圖1)。

圖1 對(duì)照組 (A)和COPD組(B)大鼠肺組織病理變化

2.2 兩組肺功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，COPD組大鼠第0.3秒用力呼氣容積與用力呼氣容積的比值(FEV0.3/FVC)降低，呼氣阻力(Ri)、吸氣阻力(Re)升高，動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cldyn)下降(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組肺功能指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 兩組肺組織TNF-α、JNK/SAPK蛋白、JNK/SAPK mRNA比較 與對(duì)照組比較，COPD組TNF-α、JNK/SAPK蛋白、JNK/SAPK mRNA表達(dá)水平升高(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組肺組織TNF-α、JNK/SAPK蛋白、JNK/SAPK mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 JNK/SAPK mRNA表達(dá)水平與TNF-α的相關(guān)性 JNK/SAPK mRNA表達(dá)水平與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.751，P<0.05)。

3 討論

COPD是一種可防治的慢性氣道炎癥性疾病，吸煙為其主要誘因，炎癥反應(yīng)為其發(fā)生發(fā)展的主要病理機(jī)制，病變部位主要涉及全部氣道、肺泡壁、肺部血管和肺實(shí)質(zhì)，涉及的細(xì)胞主要有中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，激活的炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，包括IL-8、IL-6、TNF-α、MMP-9、IL-1、GM-CSF等近50種細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者的小葉中心肺氣腫部位、小氣道、肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡灌洗液和血管有顆粒污染物殘留[11]。同時(shí)，香煙煙霧中含有丙烯醛、過(guò)氧化氫及活性氧等多種氧化物，能通過(guò)增加體內(nèi)氧化負(fù)荷及活化炎性細(xì)胞，釋放內(nèi)源性氧化劑，從而打破體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡，引起肺部炎癥[12]。另外，煙霧還可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶，導(dǎo)致蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)的失衡，損害肺組織彈力纖維，從而進(jìn)一步導(dǎo)致肺氣腫形成。鑒于COPD與吸煙密切相關(guān)以及COPD發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)、氧化損傷、蛋白酶/抗蛋白酶失調(diào)、免疫障礙等多個(gè)方面異常密切相關(guān)，因此，近年對(duì)COPD治療研究逐步受到醫(yī)學(xué)界廣泛重視。

JNK/SAPK是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，為哺乳動(dòng)物絲裂素活化蛋白激酶家族中的一員。JNK/SAPK被激活后，能通過(guò)不同的下游分子調(diào)控機(jī)體和細(xì)胞的各種功能，如mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、線粒體功能等，還可以調(diào)控細(xì)胞自噬。JNK/SAPK信號(hào)通路是機(jī)體正常與疾病狀態(tài)時(shí)細(xì)胞調(diào)節(jié)的重要靶點(diǎn)。而JNK/SAPK磷酸化，可以在炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

Oltmanns等[13]通過(guò)構(gòu)建支氣管哮喘模型發(fā)現(xiàn)，JNK是支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程中重要的信號(hào)分子，在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞分泌大量炎性因子如活性調(diào)節(jié)蛋白、粒單集落刺激因子、IL-8等。Bennett等[14]發(fā)現(xiàn)，JNK/SAPK的特異性抑制劑SP600125(一種可逆的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)可抑制c-Jun的磷酸化及一些炎癥因子如TNF-α、IL-2、INF-γ的表達(dá)。而吸煙可直接或間接損傷氣道組織細(xì)胞，使肺局部中性粒細(xì)胞聚集、巨噬細(xì)胞凋亡，并激活、釋放多種炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-2、IL-6、INF-γ、巨噬細(xì)胞炎性蛋白、粒單集落刺激因子和蛋白酶[15～17]，產(chǎn)生異常炎癥反應(yīng)，是COPD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。近年來(lái)，人們已意識(shí)到JNK/SAPK信號(hào)通路在氣道炎癥反應(yīng)中可能具有重要意義。但有關(guān)JNK/SAPK蛋白磷酸化水平的變化及其與COPD炎癥反應(yīng)機(jī)制的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建煙霧誘導(dǎo)的大鼠COPD模型，大鼠出現(xiàn)了精神萎靡，活動(dòng)量減少，寒戰(zhàn)明顯，呼吸急促，呼吸動(dòng)度增加，噴嚏較多，部分大鼠鼻部出現(xiàn)黏性分泌物，呼吸時(shí)伴有明顯痰鳴音，心率明顯加快；光鏡下出現(xiàn)了大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁變薄，部分肺泡融合，肺泡數(shù)量減少，肺泡毛細(xì)血管床減少等典型的COPD病理現(xiàn)象；肺功能提示FEV0.3/FVC明顯下降，Ri、Re升高，Cldyn下降，表明成功建立COPD大鼠模型。采集肺組織標(biāo)本，分析JNK/SAPK在肺組織中的表達(dá)及其與COPD發(fā)展的相關(guān)性。免疫組化結(jié)果顯示，COPD大鼠肺組織中JNK/SAPK蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，COPD組大鼠JNK/SAPK mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與TNF-α有顯著的線性相關(guān)關(guān)系?？紤]JNK/SAPK導(dǎo)致氣道炎癥和肺氣腫,促進(jìn)COPD發(fā)生發(fā)展，與JNK/SAPK磷酸化導(dǎo)致一些炎癥因子如TNF-α、IL-2、INF-γ的表達(dá)升高有關(guān)。而肺組織的異常炎癥反應(yīng)則是COPD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。因此JNK/SAPK在煙霧誘導(dǎo)的COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。根據(jù)以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們推測(cè)，JNK/SAPK信號(hào)通路可能通過(guò)激活煙霧誘導(dǎo)的炎癥因子來(lái)導(dǎo)致氣道炎癥和肺氣腫發(fā)病。

綜上所述，本研究初步探討了JNK/SAPK在煙霧誘導(dǎo)COPD大鼠中的表達(dá)及作用，認(rèn)為JNK/SAPK可以通過(guò)激活煙霧誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥因子，促進(jìn)氣道炎癥和肺氣腫,導(dǎo)致COPD發(fā)生。但其更加準(zhǔn)確的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探討。同時(shí)，JNK/SAPK很有可能成為COPD治療的新靶點(diǎn)，而JNK/SAPK研究理論的完善，必將為未來(lái)COPD及其他呼吸系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路。

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Changes in levels of JNK/SAPK of rats with chronic obstructive pulmonary disease

TIANXue,ZHANGXingyi,LIFeng,XIAOHui,ZHOUXin

(ShanghaiGeneralHospitalofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China)

Objective To investigate the changes in levels of c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase (JNK/SAPK) in the lung tissues of rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods Sixteen Ⅱ male Wistar rats were randomly divided into two groups: the control group and COPD group. The control group was not treated, while the COPD group was stimulated with smoke to set up COPD models. After models were established, we detected the lung pathology through optical microscope, pulmonary function through animal pulmonary instrument, TNF-α expression in lung tissue through ELISA, JNK/SAPK expression through immunohistochemistry, and JNK mRNA expression through RT-PCR. Results In the COPD group, light microscope showed that there was a large number of inflammatory cell infiltration, alveolar fusion, and alveolar reduction, which proved the COPD model was successful. Compared with the control group, FEV0.3/FVC decreased, Ri and Re increased, and Cldyn decreased (P<0.05 orP<0.01), and TNF-α increased in the COPD group (P<0.05). Immunohistochemistry showed that JNK/SAPK expression improved in the COPD group. RT-PCR result showed JNK mRNA expression increased in the COPD group as compared with that of the control group (allP<0.05). JNK mRNA expression was positively correlated with TNF-α (r=0.751,P<0.05).Conclusion The level of JNK/SAPK increases in smoke-stimulated COPD rats, which can cause airway inflammation and emphysema, and promote the occurrence of COPD through activating smoke-induced inflammatory cytokines.

chronic obstructive pulmonary disease; c-Jun N-terminal kinase; stress-activated protein kinase; effect mechanism

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81470218)；中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)呼吸免疫專項(xiàng)課題(2014)。

田雪(1984-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槁宰枞苑渭膊〉陌l(fā)病機(jī)制。E-mail:lwtianxue@126.com

周新(1953-),男，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槁宰枞苑渭膊〉陌l(fā)病機(jī)制。E-mail:xzhou53@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.005

R563.13

A

1002-266X(2016)45-0015-04

2016-09-11)