李珍，田承華，趙寧，胡振鑫，何祥坤，張秦瑩，于美珍，張生萬，田懷東,3

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西景康農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣有限公司，山西太原030000）

玻璃化保護(hù)液處理下高粱離體花粉的活力解析

李珍1，田承華2，趙寧1，胡振鑫1，何祥坤1，張秦瑩1，于美珍1，張生萬1，田懷東1,3

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西景康農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣有限公司，山西太原030000）

為了確立可顯著提高高粱花粉體外存活的水性環(huán)境條件，設(shè)計(jì)了離體高粱花粉所處的干燥（CK）、磷酸鹽溶液（PBS）、玻璃化保護(hù)液1（PVS1）、玻璃化保護(hù)液2（PVS2）、玻璃化保護(hù)液3（PVS3）等5種環(huán)境；采用TTC法，對4種水性溶液體系中浸漬處理15 min后的高粱花粉和干花粉的存活率進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，各狀態(tài)下離體高粱花粉存活率大小依次為PBS＜PVS3＜PVS2＜PVS1＜CK；與PBS中的花粉存活率相比，PVS3對花粉存活率提高不顯著，PVS1和PVS2可顯著提高花粉存活率。表明水性環(huán)境對離體花粉的活力有顯著的損傷效果；3種保護(hù)液中的甘油、乙二醇、二甲基亞砜、蔗糖等對高粱離體花粉活力有保護(hù)作用，其中，含有這4種成分的PVS1對水性環(huán)境高粱離體花粉的活力保護(hù)效果最好。研究結(jié)果有望為水性環(huán)境下高粱花粉生殖細(xì)胞基因的誘變提供技術(shù)支撐。

高粱；花粉；玻璃化保護(hù)液；離體活力

作物種質(zhì)資源是人類賴以生存的基礎(chǔ)性生物資源，在農(nóng)業(yè)、釀造、飼料、能源、食品、醫(yī)藥等多種領(lǐng)域中被廣泛利用[1]。作物種質(zhì)資源的創(chuàng)新對于遏制作物品種培育與生產(chǎn)活動中存在的種質(zhì)多樣性弱化、栽培環(huán)境惡化、營養(yǎng)品質(zhì)單一化等不良趨勢以及滿足作物資源的多樣化社會需求具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[2]。而人工誘變技術(shù)的開發(fā)與利用是作物種質(zhì)創(chuàng)新的一種有效途徑[3-4]。

國內(nèi)外采用的人工誘變法主要包括重組DNA創(chuàng)制法、物理誘變法與化學(xué)誘變法。其中，化學(xué)誘變技術(shù)是使用烷化劑、疊氮化鈉、堿基化合物等誘變劑處理植株的器官、組織或細(xì)胞，從而誘發(fā)遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，具有操作簡便、成本低、相對安全、染色體損傷小、基因變異率高、突變幅度大等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。所以，在作物育種由基因組學(xué)向蛋白組學(xué)轉(zhuǎn)向的新時(shí)代，化學(xué)誘變技術(shù)無疑是一種創(chuàng)制具有良好應(yīng)用前景的基因誘變技術(shù)。截至目前，國內(nèi)外主要使用EMS[8]，MNU[9]等化學(xué)誘變劑，用于水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物的組織器官或受精卵細(xì)胞、生殖細(xì)胞的誘變處理。其中，對作物花粉的離體誘變處理是提高作物化學(xué)誘變效率的一個(gè)主要方向。在對花粉的離體誘變處理中，誘變劑發(fā)揮效應(yīng)的溶劑環(huán)境主要是有機(jī)溶劑環(huán)境：Coe[10]首先報(bào)道，液體石蠟油可用于短期保存花粉而不影響其生命力；隨后，Neuffer[11]將此發(fā)現(xiàn)加以延伸，把石蠟油作為化學(xué)誘變劑的載體，處理玉米花粉，獲得成功，突破了化學(xué)藥劑不能直接誘變花粉的瓶頸，該方法是當(dāng)今國外誘變花粉的主要手段之一[12]。但是離體花粉的水性環(huán)境誘變處理還未見詳細(xì)報(bào)道。日本學(xué)者Satoh等[13]使用pH值4.8～5.2的MNU磷酸鹽溶液（1.0 mmol/L）、避光條件下對水稻品種（金南風(fēng)/臺中65號）穗部進(jìn)行了誘變處理，成功實(shí)現(xiàn)了對其受精卵DNA的有效誘變和突變體的開發(fā)。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，MNU的誘變效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以石蠟油為溶劑載體的EMS的誘變效率[14]。因此，如何提高水性環(huán)境體系下花粉的活力，成為進(jìn)一步開發(fā)高效的離體高粱花粉生殖細(xì)胞基因MNU誘變技術(shù)亟待解決的難題。

高粱是我國重要的旱地農(nóng)作物之一，開展對其花粉的誘變處理技術(shù)，對高粱種質(zhì)資源創(chuàng)新與優(yōu)異品種培育具有重要的意義。本研究對預(yù)先設(shè)計(jì)的4種水性環(huán)境下離體高粱花粉的存活率進(jìn)行比較分析，以探索出一種可顯著提高其活力的適宜保護(hù)液配方，將為高粱的遺傳育種提供數(shù)據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選取高粱m02-16作為供試材料，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所試驗(yàn)基地種植，采集盛花期花粉用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 用于離體高粱花粉處理的水性環(huán)境設(shè)計(jì)高粱花粉離體處于水性環(huán)境時(shí)，極易吸水脹破，活力降低。Gayle等[15]報(bào)道，甘油（Glycerol）、乙二醇（EG）、二甲基亞砜（DMSO）、蔗糖（Suc）4種成分對身體細(xì)胞具有保護(hù)作用。馮慧云等[16]報(bào)道，Glycerol與水分子具有較好的親和性，并且能在組織細(xì)胞外壁形成一層保護(hù)膜，有利于減少水分子的侵入和外界的機(jī)械損傷，Sommerfeld等[17]報(bào)道，EG容易滲透進(jìn)入細(xì)胞，降低胞內(nèi)鹽溶質(zhì)濃度，置換部分自由水，發(fā)生水合作用。方志聰?shù)萚18]報(bào)道，DMSO能夠減輕羥基自由基對細(xì)胞的破壞，改變生物膜對電解質(zhì)等的通透性，弱化水分子進(jìn)入細(xì)胞，從而起到保護(hù)作用。蔗糖分子量較大，不能滲入細(xì)胞內(nèi)，對于維持細(xì)胞內(nèi)外正常滲透壓、防止細(xì)胞過度膨脹具有重要意義[15-18]。根據(jù)這些報(bào)道，本研究設(shè)計(jì)磷酸鹽（PBS）與3種保護(hù)液（PVS）構(gòu)建4種水性環(huán)境（表1）。

表1 4種水性環(huán)境主要配方及組成成分%

1.2.2 各狀態(tài)下離體高粱花粉的活力測定采用TTC法測定花粉活力，原理如圖1所示。參考崔桂梅等[19]報(bào)道的方法，配制含有0.1 mol/L磷酸鹽的2%TTC溶液（pH值7.2）進(jìn)行染色，顯微鏡下檢測離體高粱花粉的脹破率和存活率。

花粉脹破率＝破裂的花粉粒數(shù)/總的花粉粒數(shù)×100%；花粉存活率＝顯紅色的花粉粒數(shù)/總的花粉粒數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)軟件對各狀態(tài)下離體高粱花粉活力的顯著性進(jìn)行分析；采用Duccan檢驗(yàn)法進(jìn)行P＜0.05水平上的顯著性分析。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SEM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各狀態(tài)下離體高粱花粉活力分析

由表2，3可知，剛收集到的干花粉活力很高，經(jīng)過PBS處理后，花粉脹破率高達(dá)62.33%，存活率急劇降低，僅為33.53%；經(jīng)3種配方PVS處理后，脹破率均有所下降但存活率有所上升（具體大小表現(xiàn)為CK＞PVS1＞PVS2＞PVS3＞PBS）。其中，研究發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)組的脹破率與存活率之和并非為100%，原因是因?yàn)閿?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)過程中會存在偶然誤差：小于100%是由于有些花粉粒并未著色但是沒有破裂，大于100%是由于有些已著色的花粉粒觀察過程中隨時(shí)間推移消耗花粉粒出現(xiàn)破裂?？傊?，TTC檢測結(jié)果說明保護(hù)液處理后有助于提高離體高粱花粉存活率。

表2 不同處理下花粉脹破率比較%

表3 不同處理下花粉存活率比較%

2.2 各狀態(tài)下離體高粱花粉活力的顯著性分析

使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，對表2，3進(jìn)行Duncan顯著性分析得出，干花粉和4種水性環(huán)境下離體高粱花粉脹破率和存活率的變化特征，如圖2，3所示。

由圖2，3可知，與CK相比，經(jīng)過PBS處理后離體高粱花粉活力顯著降低，存活率與脹破率呈負(fù)相關(guān)；經(jīng)過保護(hù)劑處理后，三者活力與PBS相比均有所上升，其中，PVS1，PVS2與PBS相比，對離體高粱花粉存活率的影響均顯著，且PVS1＞PVS2；PVS3與PBS相比，對離體高粱花粉存活率的影響不顯著。說明PVS1配方保護(hù)液能夠顯著提高水性環(huán)境離體高粱花粉的存活率。

2.3 PBS與PVS1處理離體高粱花粉的形態(tài)學(xué)分析

PBS與PVS1保護(hù)液處理后離體高粱花粉TTC染色結(jié)果分別如圖4所示。經(jīng)PBS浸漬處理后，離體高粱花粉明顯出現(xiàn)大量脹破現(xiàn)象，且花粉內(nèi)容物外流（如箭頭所示），花粉顆粒呈現(xiàn)黑色或近透明色，說明該條件下高粱花粉存活率極低（圖4-A）。

經(jīng)PVS1保護(hù)液處理后，高粱花粉雖仍有內(nèi)容物外流現(xiàn)象，但脹破情況出現(xiàn)明顯改觀，花粉顆粒大部分呈現(xiàn)出洋紅色，形態(tài)保持相對完整（如箭頭所示），存活率提高（圖4-B）。從形態(tài)上分析表明，PVS1保護(hù)液處理能夠顯著提高水性環(huán)境下離體高粱花粉的存活率。

3 結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道，Glycerol，EG，DMSO，Suc等4種物質(zhì)對細(xì)胞具有保護(hù)作用[15-18]。本研究結(jié)果表明，含有Glycerol，EG，DMSO或Suc成分的PVS溶液可不同程度保護(hù)離體花粉活力；其中，混合使用4種成分的PVS1保護(hù)液可顯著降低水分對離體高粱花粉的損傷，對花粉活力的保護(hù)效果最好。期望在此配方的基礎(chǔ)上，能進(jìn)一步對化學(xué)誘變處理環(huán)境進(jìn)行全面分析、設(shè)計(jì)與實(shí)施。截至目前，作物組織細(xì)胞的化學(xué)誘變處理環(huán)境主要有有機(jī)溶劑環(huán)境與水性環(huán)境。EMS-石蠟油是當(dāng)今國內(nèi)外主要使用的有機(jī)誘變環(huán)境；而Satoh等[20]的水稻受精卵基因的MNU誘變研究表明，MNU是一種水性環(huán)境下對細(xì)胞基因的高效誘變劑。本研究結(jié)果有望為水性溶液環(huán)境下的高粱生殖細(xì)胞基因的誘變提供借鑒，對于高粱的種質(zhì)創(chuàng)新與優(yōu)異品種培育具有重要的意義。

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Analysis on Sorghum Pollens Viabilityin vitroTreated in Protective Solution of Vitrification

LI Zhen1，TIANCheng-hua2，ZHAONing1，HUZhen-xin1，HE Xiang-kun1，ZHANGQin-ying1，YUMei-zhen1，ZHANGSheng-wan1，TIANHuai-dong1，3
（1.College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofSorghum，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Jinzhong030600，China；3.Shanxi JingKangAgricultural TechnologyPromotion Co.，Ltd.，Taiyuan 030000，China）

To establish the suitable aqueous environmental conditions for significantly improving the viability ofsorghum pollens in vitro,five kinds of in vitro systems were designed which were dry（CK）,phosphate buffer solution（PBS）,protective vitrified solution 1（PVS1）,protective vitrified solution 2（PVS2）,protective vitrified solution 3（PVS3）.The pollens viability of sorghum in four aqueous environmental systems,soaked 15 minutes,were compared with CKpollen byusingTTCmethod.The results showed that the sort order of pollen viabilitywas as follows:PBS＜PVS3＜PVS2＜PVS1＜CK.In comparison with the pollen viabilityin PBS,PVS3 had noobviously effect,but PVS2 and PVS1 significantly improved the pollen viability in vitro.These results indicated that the viability of the pollens in vitro were significantly decreased in the aqueous environment systems and the three kinds of PVS,containing glycerol,ethylene glycol, DMSO,sucrose,had obvious protective effects on the pollen viability in vitro of sorghum.Therefore,the PVS1,containing these four components,had more significantly effects for raising the pollen viability in aqueous environment systems.The results could provide technical support for the mutagenesis ofgenes ofsorghumpollen germcells in aqueous system.

sorghum;pollen;vitrification protection solution;viability in vitro

S514

A

1002-2481（2016）04-0463-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.10

2016-01-27

山西省科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2014101025）

李珍（1989-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：作物遺傳資源。田懷東為通信作者。