張婷

(淮北市食品藥品檢驗中心，安徽 淮北 235000)

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高效液相色譜法同時測定小兒咳喘靈口服液中綠原酸與甘草苷的含量

張婷

(淮北市食品藥品檢驗中心，安徽 淮北 235000)

目的 建立采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定小兒咳喘靈口服液中綠原酸與甘草苷含量的方法。方法 采用Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1；波長切換檢測，檢測波長為327 nm(0～16 min，測定綠原酸)和217 nm(16～64 min，測定甘草苷)；進樣量為10 μL；柱溫為30℃。結(jié)果 綠原酸在0.081 3～0.812 8 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 8),平均加樣回收率為97.5%(n=9)，RSD=2.8%；甘草苷在0.038 6～0.386 1 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 8)，平均加樣回收率為103.6%(n=9)，RSD=1.9%。結(jié)論 該方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于小兒咳喘靈口服液中綠原酸與甘草苷的含量測定。

小兒咳喘靈口服液；高效液相色譜法；綠原酸；甘草苷

小兒咳喘靈口服液收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第四冊，由麻黃、金銀花、苦杏仁、板藍根、石膏、甘草、瓜蔞等七味中藥制備而成,具有宣肺清熱，止咳、祛痰、平喘的功效，用于治療上呼吸道感染，氣管炎、肺炎、咳嗽等癥[1]。金銀花和甘草是該制劑中的重要成分，金銀花性寒，味甘，具有清熱解毒的功效，甘草性平，味甘，具有和中緩急、化痰止咳平喘的功效[2-3]。鑒于綠原酸和甘草苷分別是金銀花和甘草的主要有效成分，本文采用高效液相色譜法同時測定該制劑中綠原酸和甘草苷的含量，該方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于小兒咳喘靈口服液的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200液相色譜儀：G1310A四元泵、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器(美國Agilent科技有限公司)，SY-800超聲提取器(上海寧商超聲儀器有限公司)，XS105電子分析天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO)。

1.2 試藥 綠原酸(批號：110753-201314，來源：中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，含量以96.6%計，使用前無需干燥處理)；甘草苷(批號：111610-201106，來源：中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，含量以93.7%計，使用前無需干燥處理)；小兒咳喘靈口服液(安徽輝克藥業(yè)有限責任公司，批號：14052001、14060101、14101001)；乙腈為色譜純；甲醇、磷酸為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫為30 ℃；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表1梯度洗脫條件進行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長：0～16 min為327 nm(測定綠原酸)，16～64 min為217 nm(測定甘草苷)；進樣量為10 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品儲備液的制備 分別精密稱取綠原酸對照品10.52 mg、甘草苷對照品5.15 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品5 mL置25 mL量瓶中，加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按小兒咳喘靈口服液處方比例及制備工藝分別制備不含金銀花、甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察 分別取混合對照品溶液、供試品溶液、缺金銀花陰性樣品溶液、缺綠原酸陰性樣品溶液,按照“2.1”項色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結(jié)果陰性樣品色譜圖在與綠原酸、甘草苷對照品色譜峰相同保留時間處未見明顯色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品儲備液0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，制成系列濃度混合對照品溶液。分別精密吸取10 μL進樣測定，記錄峰面積，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸?；貧w方程：綠原酸為Y=1 628.828 7X-12.213 8(r=0.999 8)，甘草苷為Y=3 188.569 9X-5.652 4(r=0.999 8),結(jié)果表明綠原酸和甘草苷分別在0.081 3～0.812 8、0.038 6～0.386 1 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸對照品峰面積的RSD為1.3%，甘草苷對照品峰面積的RSD為0.84%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批次樣品(批號為14052001)按“2.2.2”項方法制成供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下測定含量。結(jié)果樣品中綠原酸的平均含量為0.100 g·L-1，RSD=0.43%；甘草苷的平均含量為0.047 g·L-1，RSD=0.50%；表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號為14052001)，在“2.1”項色譜條件下，分別于配置后0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.19%，甘草苷峰面積的RSD為0.72%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 分別精密量取已知含量的樣品(批號為14052001)2.5 mL，共9份，每3份1組，每組一個質(zhì)量濃度。分別精密加入“2.2.1”項下的混合對照品儲備液1.2、2.5、5 mL，按供試品溶液制備方法制備，在“2.1”項色譜條件下測定，綠原酸和甘草苷的平均回收率分別為97.5%和103.6%，RSD分別為2.8%和1.9%，結(jié)果見表2、表3，表明本方法結(jié)果準確可靠。

表2 綠原酸加樣回收率

表3 甘草苷加樣回收率

2.9 樣品含量測定 取3批樣品(批號分別為14052001、14060101、14101001)，每批2份，按供試品溶液制備方法制備，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算3批樣品中綠原酸和甘草苷的含量，結(jié)果見表4。

表4 綠原酸和甘草苷樣品測定結(jié)果/g·L-1

3 討論

小兒咳喘靈口服液收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第四冊，現(xiàn)行標準比較簡單，僅有性狀、鑒別、檢查項，無含量測定項。有文獻報道采用高效液相色譜法測定該制劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、綠原酸等成分的含量[4-5]，但無同時測定綠原酸和甘草苷含量的相關(guān)報道。本文采用高效液相色譜法，利用二極管陣列檢測器波長轉(zhuǎn)換方式同時測定綠原酸和甘草苷的含量，該方法操作簡便、準確、穩(wěn)定，達到一測多評的效果，為該制劑中綠原酸和甘草苷的質(zhì)量控制及制定新的檢驗方法提供可靠依據(jù)。

根據(jù)有關(guān)文獻報道[6-8]，綠原酸在327 nm處有最大吸收，甘草苷在217 nm處有較大吸收，經(jīng)試驗，0～16 min檢測波長設(shè)為327 nm以測定供試品溶液中綠原酸的含量，16～64 min檢測波長設(shè)為217 nm以測定供試品溶液中甘草苷的含量，結(jié)果穩(wěn)定，無雜質(zhì)峰干擾。

供試品溶液的制備，參考相關(guān)文獻[9-11]，比較了以70%甲醇、甲醇為不同的提取溶劑進行超聲和加熱回流提取。結(jié)果以70%甲醇提取的供試品溶液雜質(zhì)干擾較多，且超聲與加熱回流提取無明顯差別，故本實驗選用甲醇為提取溶劑，進行超聲提取，提取完全，雜質(zhì)干擾較少。試驗中曾取同一批樣品，比較了分別超聲提取15、30、45 min對測定結(jié)果的影響，結(jié)果超聲提取30 min后測定結(jié)果不再增加，故確定超聲提取時間為30 min。

小兒咳喘靈口服液是由多種藥味制備而成的復(fù)方制劑，按照供試品溶液制備方法制備的樣品溶液中除含有綠原酸和甘草苷外，尚含有其他多種化學成分，采用等度洗脫的方式待測組分無法與雜質(zhì)峰有效分離。參照有關(guān)文獻[12-15]，經(jīng)試驗，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，供試品溶液中綠原酸和甘草苷與相鄰組分分離完全，且出峰時間適宜，陰性溶液無干擾。

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Determination of chlorogenic acid and liquiritin in xiao’er kechuanling oral liquid by HPLC

ZHANG Ting

(HuaibeiFoodandDrugInspectionCenter，Huaibei，Anhui235000，China)

Objective To develop an HPLC method for the determination of chlorogenic acid and liquiritin in xiao’er kechuanling oral liquid．Methods The samples were analyzed by Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)with acetonitrile-0.1% phosphoric acid as mobile phase in gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1．The detection wavelength was set at 327 nm for the determination of chlorogenic acid(0～16 min)and 217nm for the determination of liquiritin(16～64 min)．The injection volume was 10 μL and the column temperature was 30 ℃．Results The linear range of chlorogenic acid was within 0.081 3～0.812 8 μg(r=0.999 8)with an average recovery of 97.5%(n=9，RSD=2.8%)．The linear range of liquiritin was within 0.038 6～0.386 1 μg(r=0.999 8)with an average recovery of 103.6%(n=9，RSD=1.9%)．Conclusion The method is convenient，highly sensitive and reproducible for the quantitative analysis of xiao’er kechuanling oral liquid．

Xiao’er kechuanling oral liquid；HPLC；Chlorogenic acid；Liquiritin

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.013

2016-06-28，

2016-09-10)