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        丹紅注射液對(duì)小鼠感染人巨細(xì)胞病毒肝炎的干預(yù)研究

        2017-01-06 06:21:33秦雪琴陳悅吳文琴雷尚芳陳德森
        安徽醫(yī)藥 2016年11期
        關(guān)鍵詞:肝功能小鼠模型

        秦雪琴,陳悅,吳文琴,雷尚芳,陳德森

        (1.十堰市太和醫(yī)院,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,a.感染科,b.急診科,湖北 十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

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        丹紅注射液對(duì)小鼠感染人巨細(xì)胞病毒肝炎的干預(yù)研究

        秦雪琴1a,陳悅1a,吳文琴1b,雷尚芳1a,陳德森2

        (1.十堰市太和醫(yī)院,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,a.感染科,b.急診科,湖北 十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

        目的 研究丹紅注射液對(duì)小鼠感染人巨細(xì)胞病毒(HCMV)病毒性肝炎的干預(yù)機(jī)制,為臨床治療HCMV提供理論依據(jù)。方法 BALB/c 品系小鼠80只,隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)法分對(duì)照組、模型組、丹紅注射液A、B、C組(腹腔注射丹紅注射液,劑量分別為0.5、1、2 mg·10 g-1·d-1),對(duì)照組、模型組用生理鹽水干預(yù)治療,連續(xù)28 d。28 d后尾靜脈采血,放免法檢測(cè)小鼠血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)[Ⅳ型膠原(cⅣ)、層黏連蛋白(LN)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl(TGF-βl)、透明質(zhì)酸(HA),Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)],用小鼠尾靜脈血血清檢測(cè)肝功能五項(xiàng)[天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBil)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)];檢測(cè)肝臟組織中肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶[CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9]活性。結(jié)果 與模型組比較,丹紅注射液B、C組治療28 d后,P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性、血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ及肝功能AST、ALT均有不同程度降低(P<0.05),均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。丹紅注射液A組各指標(biāo)間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,B、C組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 丹紅注射液可抑制小鼠P450亞型酶活性,降低藥物代謝時(shí)對(duì)肝臟的毒性,并通過(guò)降低TGF-βl而促進(jìn)肝功能恢復(fù),對(duì)小鼠感染,HCMV病性肝炎有明確的治療作用。

        丹紅注射液;人巨細(xì)胞病毒肝炎;細(xì)胞色素P450亞型酶酶;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl;肝功能

        人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是雙鏈線狀DNA病毒,屬皰疹病毒科,其主要生物學(xué)特征為同期性潛伏-活動(dòng)[1]。HCMV病毒普遍存在于自然界,當(dāng)?shù)挚沽ο陆禃r(shí)病毒侵入機(jī)體感染肝臟、血液及神經(jīng)系統(tǒng); 如感染肝臟會(huì)造成嚴(yán)重的肝功能損傷,如肝脾腫大、高膽紅素血癥、病理性黃疸,隨著病毒大量復(fù)制繁殖,肝臟組織嚴(yán)重受損,最終將發(fā)展為肝纖維化,并因肝衰竭而造成致死性損傷[2]。本實(shí)驗(yàn)研究首先建立小鼠HCMV肝炎動(dòng)物模型,觀察丹紅注射液對(duì)其細(xì)胞色素P450亞型酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl(TGF-βl)及肝功能等的影響,探討丹紅注射液保肝護(hù)HCMV肝炎的作用機(jī)制,以期其應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療HCMV病毒性肝炎提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物及分組 BALB/c 品系小鼠80只,雌雄各半,體質(zhì)量22~25 g,周齡10~11周,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,合格證編號(hào)為SCXK(京)2005-0013。小鼠采用自由配對(duì)原則,隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分為對(duì)照組,模型組,丹紅注射液按經(jīng)腹腔注射劑量的不同分A、B、C組,每組16只(雌雄比為1∶1,每組8對(duì)16只)。

        1.2 儀器及試劑 Waters2010型高效液相色譜儀;HCMV-AD169病毒(6.0 logTCID50/mL病毒株)作為實(shí)驗(yàn)用毒種[3];丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司提供,批號(hào):Z20026866)。

        1.3 造模及干預(yù)方法 參照文獻(xiàn)資料[4],模型組及丹紅注射液A、B、C組分別經(jīng)腹腔內(nèi)接種HCMV-AD169病毒株的病毒懸液[1.0 mL/(6.0logTCID50/mL)],對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水(每只1.0 mL)。對(duì)照組新生小鼠肝組接種后配對(duì)分開(kāi)飼養(yǎng),記錄受精時(shí)間,待所有新生小鼠出生后第10 天開(kāi)始干預(yù)治療,干預(yù)前5組動(dòng)物中隨機(jī)挑選每對(duì)小鼠生產(chǎn)的新生小鼠1只(每組各8只新生小鼠)。對(duì)照組及模型組腹腔注射0.5 mL生理鹽水,丹紅注射液A、B、C組經(jīng)腹腔注射丹紅注射液(0.5、1、2 mg·10 g-1·d-1)進(jìn)行干預(yù),全部動(dòng)物均干預(yù)治療28 d。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物福利:飼養(yǎng)環(huán)境要求動(dòng)物房恒溫(22 ℃,濕度50%~75%),配對(duì)分開(kāi)飼養(yǎng)單籠飼養(yǎng),12 h交替光照;飼養(yǎng)要求滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理[5],小鼠自由飲水,普通飼料喂養(yǎng),觀察動(dòng)物飲水進(jìn)食情況,小鼠生產(chǎn)新生小鼠后及時(shí)清理糞便。本模型建立選用目前成熟可靠的技術(shù),利用HCMV可經(jīng)胎盤垂直傳播至子代新生小鼠的生物學(xué)特性,且經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對(duì)子代小鼠尾靜脈血分離培養(yǎng)均得出HCMV-DNA的陽(yáng)性結(jié)果,造模成功率為100%。

        1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 參照文獻(xiàn)[6],小鼠斷尾后用取樣器吸取靜脈血0.1 mL,置于已編號(hào)的肝素管中,放免法檢測(cè)小鼠血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)[Ⅳ型膠原(cⅣ)、層黏連蛋白(LN)、TGF-βl、透明質(zhì)酸(HA),Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)],常規(guī)檢測(cè)小鼠肝功能五項(xiàng)[天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBil)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)] 。小鼠取血后,斷頭處死,取肝組織置于已編號(hào)的容器內(nèi)放入-4 ℃冰箱暫存,采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)P450亞型酶。檢測(cè)前先將肝組織搗碎研磨,4 ℃下按1∶4比例加入勻漿緩沖液(11.5 g·L-1氯化鉀,50 mmol·L-1Tris,pH 7.4)勻漿,用GR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)差速離心法勻漿,5 000 r·min-1離心30 min后離心管中沉淀的組織重懸于0.25 mol·L-1蔗糖溶液中即為小鼠肝微粒體提取液標(biāo)本,分別編號(hào)置于-80 ℃冰箱暫存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)取出標(biāo)本置于SHA-C水浴恒溫振蕩器解凍并振蕩30 min,37 ℃先孵育30 min,再5 000 r·min-1離心20 min 后用取樣器取上清液 250 μL備用,采用Waters 2010型高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)。P450酶含量測(cè)定: 用 pH 7.4 的磷酸緩沖液將提取的小鼠肝微粒體提取液(250 μL上清液)加入 4 mg 連二亞硫酸鈉,反應(yīng) 4 min,將其平分到比色皿中,在紫外分光光度計(jì)上掃描基線, 然后向樣品杯中通入 CO 30 s,穩(wěn)定 5 min,在波長(zhǎng) 400~500 nm 范圍內(nèi)掃描得到P450-CO 復(fù)合物吸收光譜。 計(jì)算公式:P450含量(μmol·L-1)=[△OD(450~490 nm)×1 000]/[91×微粒體蛋白濃度(g·L-1)]。

        2 結(jié)果

        2.1 丹紅注射液對(duì)小鼠P450亞型酶的影響 如表1。對(duì)照組P450亞型酶酶中CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9活性均保持正常水平。模型組P450亞型酶表達(dá)均明顯增強(qiáng),與對(duì)照組比較,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。丹紅注射液B、C組經(jīng)28 d治療,CYP2E1、 CYPIA2、CYP3A4明顯降低,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B、C組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),丹紅注射液A組有下降趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        2.2 丹紅注射液對(duì)小鼠血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的影響 見(jiàn)表2。模型組小鼠血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)(cⅣ、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ)顯著升高,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明母代小鼠均感染HCMV病毒, HCMV已垂直傳播給子代小鼠,HCMV病毒增殖造成肝纖維化病理改變。丹紅注射液B、C組經(jīng)28 d治療,cIV、TGF-βl及PC-Ⅲ明顯降低,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B、C組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但丹紅注射液A組降低不明顯(P>0.05)。2.3 丹紅注射液對(duì)小鼠肝功能的影響 模型組小鼠肝功能五項(xiàng)(AST、TBA、TBiL、GGT、ALT)均顯著升高,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明子代小鼠均感染HCMV病毒后造成嚴(yán)重的肝功能損害。丹紅注射液B、C組經(jīng)28 d治療,AST及ALT明顯降低,與模型組比較,P<0.05,B、C組組間比較(P>0.05)。TBA、GGT 、TBil有下降趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),丹紅注射液A組僅AST差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表3。

        3 討論

        機(jī)體感染HCMV后在肝臟組織復(fù)制繁殖,破壞肝細(xì)胞,造成大量肝細(xì)胞變性、壞死,肝星狀細(xì)胞被激活、增殖和轉(zhuǎn)化等病理改變并最終導(dǎo)致肝臟組織纖維化而喪失解毒功能,肝功能及血清肝纖維化血清學(xué)等指標(biāo)異常升高。P450同工酶是主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng),是機(jī)體混合功能氧化酶系的主要成分,有數(shù)十種亞型,目前證實(shí)與藥物代謝關(guān)系密切的有CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9等[7]。藥物90%均經(jīng)P450亞型酶代謝,故影響P450亞型酶活性的藥物均會(huì)影響藥物的療效, P450亞型酶活性增強(qiáng)常會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏等不良反應(yīng),并造成藥物的治療作用降低,而P450亞型酶活性降低會(huì)使經(jīng)此酶代謝藥物代謝減慢,血藥濃度升高而增強(qiáng)療效[8]。近年來(lái)大量中草藥提取液如丹紅注射液等被嘗試應(yīng)用到臨床治療HCMV并取得一定療效,丹紅注射液是將中藥丹參、紅花按科學(xué)配方提取的復(fù)方注射液?!端幤坊x》記載紅花味辛性溫、善通利經(jīng)脈,《吳普本草》記載丹參味辛性涼、可治心肌腹痛[9]。丹參主要有效成分包括丹參酚酸、丹參酮、紅花黃色素等,其性苦,微寒,歸心、心包、肝經(jīng),既能活血又可清熱;紅花主要成分有紅花素、紅花醌及紅花苷等,辛溫,歸心、肝經(jīng),具活血化瘀之效,同時(shí)辛溫之性有助于化痰濕,兩藥合用共奏活血清熱化痰之功[10],兩藥一溫一涼,具有調(diào)經(jīng)鎮(zhèn)痛、涼血消癰、活血通經(jīng)、散癖鎮(zhèn)痛之功效,能有效降低血液黏稠度、改善微循環(huán),正合中醫(yī)治療肝病的原則[11]。

        觀察發(fā)現(xiàn),小鼠感染HCMV后出生的新生代小鼠均垂直傳染HCMV病毒,因?yàn)槌龑?duì)照外,其它4組小鼠cIV、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ及肝功能五項(xiàng)(AST、TBA、TBil、GGT、ALT)均異常增高。在用丹紅注射液干預(yù)治療28 d后,模型組P450亞型酶活性、cIV、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ及肝功能五項(xiàng)(AST、TBA、TBil、GGT、ALT)均無(wú)明顯改善,而丹紅注射液B、C組P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性、血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)中cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ及肝功能AST、ALT均明顯降。多項(xiàng)研究表明,P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4與藥物代謝及相互作用密切相關(guān),其降低有利于藥物的代謝并減少不良反應(yīng)、增加療效[12]。丹紅注射液B、C組P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性降低的機(jī)制因缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告,但在本臨床觀察印證丹紅注射液確具有降低CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性的作用。丹紅注射液B、C組的cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ等指標(biāo)的下降應(yīng)與丹紅注射液具有活血化瘀,增加肝血流量進(jìn)而改善肝臟組織微循環(huán)有關(guān)。HCMV病毒在肝臟增殖時(shí)會(huì)對(duì)正常肝細(xì)胞造成嚴(yán)重破壞,肝細(xì)胞壞死時(shí)Na+,K+-ATP酶活性會(huì)降低,肝細(xì)胞能量的代謝障礙,并導(dǎo)致肝細(xì)胞修復(fù)能力下降。結(jié)合機(jī)體電生理特點(diǎn)來(lái)看,丹紅注射液可能具有增強(qiáng)了Na+,K+-ATP酶活性,促使cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ降低,抑制HCMV病毒對(duì)肝細(xì)胞的破壞,改善肝細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)代謝而起到細(xì)胞保護(hù)作用[13]。另外,HCMV會(huì)造成小鼠肝臟蛋氨酸腺苷蛋氨酸環(huán)化酶和Na+,K+-ATP酶活性降低,模型組及丹紅注射液A、B、C組小鼠肝細(xì)胞大量破壞、腫脹、變性壞死,造成小鼠肝功能異常升高。在使用丹紅注射液干預(yù)治療28 d后,丹紅注射液B、C組肝功能中AST、ALT明顯降低,說(shuō)明其對(duì)已感染HCMV的肝臟具有保護(hù)作用。大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)丹紅注射液具有活血化瘀,涼血消癰的藥理特性[14]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到丹紅注射液可抑制小鼠P450亞型酶活性,這對(duì)降低藥物代謝時(shí)對(duì)肝臟的毒性,增強(qiáng)藥物療效,促進(jìn)肝功能恢復(fù)起到了至關(guān)重要的作用。丹紅注射液還通過(guò)降低TGF-βl而促進(jìn)肝功能恢復(fù),并有可能具有增強(qiáng)Na+,K+-ATP酶泵功能,促進(jìn)質(zhì)膜磷脂甲基化,改善肝臟組織微循環(huán),增加肝臟組織供氧,抑制HCMV增殖引起的炎性反應(yīng)造成的肝損傷而達(dá)到保護(hù)肝臟的目的,對(duì)小鼠感染HCMV病毒病性肝炎有明確的干預(yù)治療作用。

        表1 小鼠P450 亞型酶活性比較

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

        表2 小鼠肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)比較

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。

        表3 小鼠肝功能五項(xiàng)比較

        注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型比較,bP<0.05。

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        Intervention of danhong injection on mice infected with hepatitis HCMV

        QIN Xueqina,CHEN Yuea,WU Wenqinb,et al

        (a.DepartmentofInfectiousDiseases,b.EmergencyDepartment,TaiheAffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

        Objective To explore the intervention mechanism of Danhong Injection on mice infected with human cytomegalovirus(human cytomegalovirus,HCMV)viral hepatitis,to provide theoretical basis for clinical treatment of HCMV.Methods Eighty BALB/c strain mice were randomized into control group,model group,Danhong Injection A,B,C group,by intraperitoneal injection of Danhong Injection(0.5,1,2 mg·10 g-1·d-1).The control group and model group received normal saline intervention therapy for 28 days.28 days later,blood samples were collected from tail vein for immunoassay detection of serum markers of liver fibrosis in mice [Ⅳ collagen(cⅣ),laminin(LN),transforming growth factor beta 1(TGF-β1),hyaluronic acid(HA),type Ⅲ procollagen(PC-Ⅲ)],detection of liver functions in mice [aspartate aminotransferase(AST),bile acid(TBA),total bilirubin(TBil),gamma glutamyl transferase(GGT)alanine aminotransferase(ALT)],and the activities of liver microsomal cytochrome P450isoforms [CYP2E1,CYPIA2,CYP3A4,CYP2D6 AND CYP2C9].Results Compared with the model group,28 days after the treatment,activities of CYP2E1,CYPIA2 and CYP3A4,cIV,TGF-βl,PC-III,AST and ALT were all decreased in Danhong Injection B and C group with significant differences(P<0.05).There was no statistically significant difference among Danhong Injection A,B and C group(P>0.05).Conclusions Danhong Injection can inhibit the activity of P450isoforms in mice,decrease toxicity to liver during drug metabolism and promote the recovery of liver function by reducing TGF-βl,which achieves obvious efficacy on mice-infected human cytomegalovirus hepatitis.

        Danhong injection;Human cytomegalovirus hepatitis;Cytochrome P450enzyme;Transforming growth factor beta 1;Liver function

        湖北省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目(WJ2015MB224)

        陳德森,男,副教授,研究方向:HCMV肝炎治療與肝移植,E-mail:fenyanqin163163@126.com

        10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.008

        2016-05-11,

        2016-08-07)

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