臧 皓，徐 倩，滕 云，張海豐

(1.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林通化134002;2.通化市通化縣三棵榆樹鎮(zhèn)中心校，吉林通化134002)

肌肽酯類衍生物脾細(xì)胞增殖活性及血漿穩(wěn)定性研究*

臧 皓1，徐 倩1，滕 云2，張海豐1

(1.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林通化134002;2.通化市通化縣三棵榆樹鎮(zhèn)中心校，吉林通化134002)

目的:研究肌肽酯類衍生物的脾細(xì)胞增殖活性及血漿穩(wěn)定性.方法:應(yīng)用小鼠的脾臟和健康人的血漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究.結(jié)果:脾細(xì)胞增殖活性測試結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度下，大部分化合物表現(xiàn)出一定的脾細(xì)胞增殖活性，特別是化合物3b、3c、3d 和3e對脾細(xì)胞的增殖活性高于陽性對照ConA.血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與肌肽相比，10個化合物均具有很好的血漿穩(wěn)定性.結(jié)論:化合物3b、3c、3d和3e具有良好的血漿穩(wěn)定性和脾細(xì)胞增殖活性，具有深入研究的價(jià)值.

肌肽;酯類衍生物;脾細(xì)胞增殖;血漿穩(wěn)定性

肌肽是一種內(nèi)源性二肽，具有清除活性氧和活性氮的功能，同時(shí)還具有螯合金屬離子作用，可以清除脂質(zhì)自氧化產(chǎn)生的α，β－不飽和醛［1－2］，肌肽還可以保護(hù)蛋白免于非酶糖化反應(yīng)［3－4］.近年來，研究發(fā)現(xiàn)肌肽還具有抗腫瘤、治療白內(nèi)障、糖尿病腎病和阿爾茨海默病、肝臟疾病和眼科疾病等多種藥理作用.而且肌肽性質(zhì)溫和，幾乎沒有毒副作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.然而，血漿中的肌肽酶能迅速把肌肽水解生成β－丙氨酸和L－組氨酸，阻止肌肽發(fā)揮治療作用，因此，對肌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、得到血漿穩(wěn)定性好、活性高的化合物一直是研究的熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)主要研究肌肽酯類衍生物3a－3j是否具有脾細(xì)胞增殖作用及良好的血漿穩(wěn)定性.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品

肌肽酯類衍生物3a－3j按照之前的方法［5］制備，它們是對肌肽羧基位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，與醇進(jìn)行酯化反應(yīng)得到的，結(jié)構(gòu)見圖1.

1.2 試劑與儀器

圖1 肌肽酯類衍生物的結(jié)構(gòu)式

25～40歲健康成年人的血漿(長春市中心血站)，胎牛血清(美國Gibco公司)，RPMI 1640(美國Gibco公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)，青霉素鈉(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，硫酸鏈霉素(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，WST－1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(北京東方德教育科技有限公司)，2010型高效液相色譜儀(日本島津公司)，BIO－RAD－680型酶標(biāo)儀(美國Bio－Rad公司);Heraeus HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司).

2 生物活性實(shí)驗(yàn)

2.1 脾細(xì)胞增殖活性

將2只小鼠麻醉后脫椎處死，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中約10min，將脾取出放在已滅菌的培養(yǎng)皿中，加入5mL胎牛血清(FBS)/1640完全培養(yǎng)基，將脾剪碎，用3～4層紗布過濾，收集濾液，以轉(zhuǎn)速1000 r/min離心10min，棄去上清液.加入10mL完全培養(yǎng)基，吹打成均勻的懸浮細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為10%體積分?jǐn)?shù)的FBS/1640培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)至106個/mL，以100μL/孔將細(xì)胞懸浮液接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組樣品濃度分為高中低三種濃度，分別為20μg/mL、100μg/mL、500μg/mL.每孔接種100μL/孔，空白對照每孔接種100μL的1640培養(yǎng)基，陽性對照組每孔接種20μL濃度為5μg/mL的伴刀豆蛋白(ConA)，每組設(shè)3個復(fù)孔.置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，以轉(zhuǎn)速1000 r/min離心10min，將96孔板傾斜30o，小心吸去上清液.每孔加入100μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，用酶標(biāo)儀于490nm測定吸光值，按照下式計(jì)算增殖率，結(jié)果列于表1.

細(xì)胞增殖率(%)=［(給藥組A490nm-空白對照組A490nm)/空白對照組A490nm］×100%

表1 化合物3a－3j的脾細(xì)胞增殖活性評價(jià)

2.2 血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用25～40歲成年人的血漿，底物的濃度為1.5mmol/L，用pH=7.4的磷酸緩沖鹽配制，血漿未經(jīng)稀釋直接與等體積底物混合，于37℃孵化2h，每30min取樣1次，用血漿2倍體積的冷乙腈終止反應(yīng)，立即混合后以轉(zhuǎn)速12000 r/min離心10min，用0.45μm的有機(jī)濾膜過濾后直接注入液相色譜儀測試，根據(jù)底物峰面積減少計(jì)算其水解程度.

根據(jù)時(shí)間對肌肽的含量作圖得到圖2，可得肌肽的降解方程:y=－0.059x+0.9936，R2= 0.9983，可見肌肽的水解成線性由方程得到肌肽的血漿半衰期t1/2=8.37min.其他化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

圖2 肌肽血漿穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 化合物3a－3j的血漿穩(wěn)定性評價(jià)

3 結(jié)果與討論

從表1可以看出，肌肽酯類衍生物在三種濃度下都有增殖脾細(xì)胞的作用，但不是呈線性分布，增殖率最高的往往出現(xiàn)在低濃度組和中濃度組，這表明化合物的濃度對脾細(xì)胞的增殖率影響很大，合適的濃度設(shè)置是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肌肽并沒有顯示出脾細(xì)胞增殖作用，相反還有輕微的抑制作用.化合物3b的低濃度組增殖率為123.2%，中濃度組為95.6%，均超過陽性對照組，高濃度組增殖率為67.8%，也與陽性對照組非常接近，說明3b在低濃度時(shí)即對脾細(xì)胞有很好的增殖作用;化合物3c在中濃度時(shí)的增殖率為70.5%，也超過陽性對照組，說明3c在中濃度時(shí)對脾細(xì)胞有不錯的增殖效果;化合物3d在低濃度組增殖率為93.8%，也超過陽性對照組，顯示了很好的增殖作用;化合物3e在高濃度組增殖率為69.5%，也略高于陽性對照組，其余的肌肽酯類衍生物均具有中等強(qiáng)度的脾細(xì)胞增殖作用.這說明通過對肌肽羧基結(jié)構(gòu)修飾成酯基可以增加肌肽對脾細(xì)胞增殖作用，使肌肽衍生物具有新的藥理活性.

通過研究發(fā)現(xiàn)，脾細(xì)胞增殖活性高于陽性對照組的四個化合物3b－3e的碳鏈長度為2～4之間，過長或過短都使增殖活性降低，為以后設(shè)計(jì)合成肌肽酯類衍生物的碳鏈長度提供依據(jù).通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)肌肽并沒有顯示出脾細(xì)胞增殖作用，相反，還有輕微的抑制作用.雖然有文獻(xiàn)［6］顯示服用肌肽可以使應(yīng)激小鼠脾細(xì)胞的個數(shù)不下降，但并未得出肌肽可以使脾細(xì)胞增殖的結(jié)論，可能肌肽在體內(nèi)是通過其他途徑發(fā)揮的作用.而肌肽酯類衍生物對脾細(xì)胞增殖活性很好，且有4個化合物的增殖率超過陽性對照組，由此證明:肌肽酯類衍生物具有有絲分裂原的作用，具有較強(qiáng)的提高免疫力的作用，這4個化合物具有進(jìn)一步研究的價(jià)值.

從血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，通過對肌肽的結(jié)構(gòu)修飾，極大地提高了肌肽衍生物的血漿穩(wěn)定性.肌肽的半衰期僅為8.37min，而修飾得到的化合物2h的水解率均未超過5%，與肌肽相比，它們的水解很緩慢，血漿中的相對穩(wěn)定可以保證它們溫和地水解成肌肽，使肌肽達(dá)到治療濃度從而發(fā)揮治療作用.與肌肽酰胺類衍生物相比［7］，肌肽酯類衍生物的血漿穩(wěn)定性相對差一些，因?yàn)檠獫{中存在酯酶，它們會使酯鍵斷裂從而得到肌肽，肌肽再被肌肽酶水解得到L－組氨酸和β－丙氨酸，而酰胺鍵在這些酶的存在下相對穩(wěn)定，不易水解成肌肽，這也阻止肌肽酰胺類衍生物發(fā)揮藥理作用.通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肌肽的不穩(wěn)定基團(tuán)是肽鍵，它是肌肽酶主要的識別位點(diǎn)，通過對肌肽的羧基修飾成酯，改變了肌肽的結(jié)構(gòu)，增加了肽鍵附近的空間位阻，使血漿中的肌肽酶無法識別出結(jié)合位點(diǎn)從而提高了化合物的血漿穩(wěn)定性.血漿穩(wěn)定性是化合物成藥性的關(guān)鍵一環(huán)，它決定候選化合物是否有機(jī)會成為藥物，肌肽是一個多功能的化合物，有著許多重要的藥理活性，但阻止其成為藥物的關(guān)鍵因素就是血漿穩(wěn)定性差，半衰期短，通過結(jié)構(gòu)修飾極大地提高了其血漿穩(wěn)定性，使其成藥性的幾率大大增加，離開發(fā)成為藥物更近了一步.

綜上，化合物3b、3c、3d和3e具有良好的血漿穩(wěn)定性和脾細(xì)胞增殖活性，具有深入研究的價(jià)值.

［1］Aldini G，Carini M，Beretta G，et al.Carnosine is a quencher of 4－h(huán)ydroxy－nonenal:through what mechanism of reaction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，298(5):699－706.

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(責(zé)任編輯:王海波)

R914

1008－7974(2016)06－0060－03

10.13877/j.cnki.cn22－1284.2016.12.019

2016－08－26

吉林省教育廳項(xiàng)目“基于UPLC－Q－TOF－MS的代謝組學(xué)技術(shù)研究草蓯蓉抗衰老的作用機(jī)理”(吉教科合字［2013］第399號)

臧皓，吉林長春人，博士研究生，講師.

張海豐，博士研究生，副教授.Email:dragon1976999@163.com