蘧苗苗， 陳銀萍， 蘇向楠， NGABIRE Maurice， 楊 波，柯昀琪， MUKUNDWA Anne Marie

( 蘭州交通大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院， 蘭州 730070 )

鎘脅迫下紫花苜蓿幼苗內(nèi)源一氧化氮和活性氧的生成

蘧苗苗， 陳銀萍*， 蘇向楠， NGABIRE Maurice， 楊 波，柯昀琪， MUKUNDWA Anne Marie

( 蘭州交通大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院， 蘭州 730070 )

鎘脅迫， 紫花苜蓿， 一氧化氮， 活性氧

重金屬由于其毒性大、難清除和可生物積累而受到廣泛關(guān)注(Nath et al，2013；Chaudhuri et al，2014)。特別是近年來，隨著全球人口快速膨脹、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)迅速發(fā)展，重金屬大量排放，從而嚴(yán)重影響了人類環(huán)境與社會可持續(xù)發(fā)展(Xu et al，2014)。據(jù)環(huán)保部與國土資源部聯(lián)合公布的全國土壤污染公報(bào)顯示，全國土壤點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)16.1%，其中以Cd污染最為嚴(yán)重，樣點(diǎn)超標(biāo)率達(dá)到7.0%，形勢十分嚴(yán)峻(全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)，2014)。Cd在植物體內(nèi)積累會刺激或抑制酶活性，影響組織蛋白質(zhì)合成，抑制植物細(xì)胞分裂和伸長(廖柏寒等，2010)；抑制植物對水分的吸收和運(yùn)輸，抑制光合作用和呼吸作用，傷害細(xì)胞膜系統(tǒng)，阻礙植物生長(崔秀敏等，2011)；并通過食物鏈在人體內(nèi)累積危害人的健康(Agrawal & Mishra，2009)。因此，研究Cd污染對植物生長發(fā)育的影響有重要意義。

苜蓿是世界范圍內(nèi)普遍種植的牧草植物，已有報(bào)道顯示紫花苜蓿(Medicagosativa，alfalfa)具有清除土壤中高含量Cu、Zn等重金屬的潛力(王文星等，2006；代惠萍等，2014)，是一種很有應(yīng)用前景的土壤修復(fù)植物(孫寧驍，2015)，而環(huán)境中的Cd會影響紫花苜蓿的種子萌發(fā)、生長和幼苗的生理特性(孫園園等，2014；孫寧驍?shù)龋?015)。雖然已有研究表明適當(dāng)濃度的外源NO可以增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，緩解Cd 脅迫對紫花苜蓿幼苗的傷害(陳銀萍等，2015)，但是目前關(guān)于Cd脅迫下紫花苜蓿內(nèi)源NO和ROS的產(chǎn)生等報(bào)道卻相對較少?；谏鲜稣J(rèn)識，本研究以紫花苜蓿幼苗為材料，在水培條件下研究不同濃度Cd處理后紫花苜蓿幼苗根、莖和葉片內(nèi)源NO和ROS以及膜脂過氧化作用變化的機(jī)制，旨在分析紫花苜蓿幼苗遭受Cd脅迫時的生理生態(tài)效應(yīng)，以期為探索重金屬Cd脅迫下紫花苜蓿的損傷、防衛(wèi)機(jī)制的誘發(fā)等方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試紫花苜蓿品種為甘農(nóng)三號 (MedicagoSativacv. Gannong No.3)，購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。測量NO含量和NOS活性的NO試劑盒和NOS試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。CD脅迫處理用CDCL2· 2.5 H2O(國藥試劑)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 測定方法

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用STATISTICA和EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖。不同處理組間的比較用單因素方差分析，多重比較采用Duncan新復(fù)方極差法(α=0.05)，相關(guān)性分析用逐步回歸分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下幼苗NO含量及NO的產(chǎn)生途徑

2.1.1 紫花苜蓿幼苗NO含量 Cd處理顯著提高了紫花苜蓿幼苗根、莖和葉的NO含量(P<0.05)。0.5、1.0、0.25 mmol·L-1Cd處理分別使幼苗根、莖和葉中的NO含量達(dá)最大，與CK相比分別提高了142.63%、142.63%、119.53%(P<0.05)。隨著Cd處理濃度進(jìn)一步增大，幼苗根、莖和葉中NO含量呈急劇下降趨勢。其中，根和葉的NO含量在顯著下降之后仍能維持高于CK的水平(根：P<0.05；葉：P>0.05)；而2.0 mmol·L-1Cd處理使莖中的NO含量至最低，與CK相比下降了9.10%(P<0.05)?？傮w而言，同濃度Cd處理下，幼苗中NO含量為葉>莖>根，唯1.0 mmol·L-1Cd處理時為莖>葉>根(圖1)。

圖 1 Cd脅迫對紫花苜蓿幼苗根、莖和葉中NO含量的影響 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Fig. 1 Effects of Cd on the NO content in alfalfa seedlings (mean ± SE) Different small letters mean significant differences(P <0.05). The same below.

2.1.2 紫花苜蓿幼苗NO的產(chǎn)生途徑 NOS是催化精氨酸形成NO的關(guān)鍵酶(邵小杰和楊洪強(qiáng)，2010)。在不同濃度Cd處理下，紫花苜蓿幼苗根、莖和葉中的NOS活性總體呈先升高后降低的趨勢(P<0.05)。其中， 0.25、0.5和0.5 mmol·L-1Cd處理分別使得幼苗根、莖和葉中的NOS活性達(dá)最高，相比CK分別提高了46.68%、137.78%和1495.93%(P<0.05)。相對地， 2.0 mmol·L-1Cd處理使得幼苗根和葉中的NOS活性至最低，相比CK分別降低了81.4%和20.26%(P<0.05)；而1.5 mmol·L-1Cd處理使莖中的NOS活性較最高值雖已顯著降低，但仍比CK高42.12%(P<0.05)。另外，低濃度Cd處理下幼苗NOS活性為根>莖>葉；而高濃度Cd處理下幼苗NOS活性為莖>根>葉(圖2:A)。

NR能以NADH作為電子供體，催化NO2-的單電子還原合成NO(田華等，2009)。在不同濃度Cd脅迫下，紫花苜蓿幼苗的根、莖和葉中NR活性總體呈先升高后降低的趨勢。其中，0.125、0.5和0.5 mmol·L-1Cd處理分別使幼苗根、莖和葉中的NR活性達(dá)到最高，相比CK分別提高了24.47%、35.64%和149.53%(P<0.05)。相對地， 2.0 mmol·L-1Cd處理使幼苗根、莖和葉中的NR活性分別降至最低，相比CK分別降低了10.67%(P<0.05)、28.30%(P<0.05)和8.44%(P>0.05)。此外，紫花苜蓿幼苗NR活性為葉>莖>根；同濃度Cd處理下，幼苗NR活性的變化幅度也是葉>莖>根(圖2:B)。

在酸性還原性條件下，植物組織中NO2-可通過發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生NO(徐茂軍，2009)。不同濃度Cd處理下，紫花苜蓿幼苗根、莖和葉中的NO2-含量總體也是呈先增大后減小的趨勢。其中， 0.125、 0.25和0.125 mmol·L-1Cd處理分別使得幼苗根、莖和葉中的NO2-含量達(dá)最大，相比CK分別提高了36.11%、16.77%和222.81%(P<0.05)。相對地， 1.5和2.0 mmol·L-1Cd處理分別使得幼苗根和莖中的NO2-含量至最小，相比CK分別降低了66.67%和24.07%(P<0.05)；而2.0 mmol·L-1Cd處理雖使得幼苗葉中NO2-含量較最大值已顯著降低，但仍比CK增加了19.30%(P<0.05)。此外還可看出，幼苗NO2-含量為葉>莖>根；同濃度Cd處理下，幼苗NO2-含量的變化幅度為葉>根>莖(圖2:C)。

光介導(dǎo)的Car可將NO2轉(zhuǎn)化成NO(張洪艷等，2009)。Cd處理使幼苗莖和葉中的Car含量發(fā)生了顯著變化(P<0.05)。其中， 1.5 mmol·L-1Cd處理使莖中Car含量達(dá)到最大，較CK增加了293.94%(P<0.05)；而在2.0 mmol·L-1Cd處理下，Car含量較最大值急劇降低，但仍比CK高9.09%(P>0.05)。相似地， 0. 25 mmol·L-1Cd處理顯著提高了幼苗葉中的Car含量，與CK相比增加了13.17%(P<0.05)；但隨著Cd處理濃度的進(jìn)一步增大，葉中Car含量急劇下降，在2.0 mmol·L-1時達(dá)到最低，相比CK降低了62.55%(P<0.05)。此外，紫花苜蓿幼苗Car含量總體為葉>莖；同濃度Cd處理下，幼苗Car含量的變化幅度則是莖>葉(圖2:D)。

圖 2 Cd脅迫對紫花苜蓿幼苗NOS活性(A)、NR活性(B)、NO2-含量(C)和Car含量(D)的影響Fig. 2 Effects of Cd on NOS activity (A)，NR activity (B)，NO2- content (C) and Car content (D) in alfalfa seedlings

圖 3 Cd脅迫對紫花苜蓿幼苗H2O2含量(A)、MDA含量含量(C)和REC(D)的影響Fig.

2.2 Cd脅迫下幼苗根、莖和葉中ROS的生成

H2O2是植物細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的一種活性氧。不同濃度的Cd處理顯著提高了紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的H2O2含量(P<0.05)。其中， 2.0、0.5和1.0 mmol·L-1Cd處理使幼苗根、莖和葉中的H2O2含量分別達(dá)到了最大值，相比CK分別增加了139.13%、121.21%和122.22%(P<0.05)(圖3:A)。

MDA是植物膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量直接反映細(xì)胞損傷程度(劉周莉等，2009)。不同濃度的Cd處理顯著提高了紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的MDA含量(P<0.05)。其中1.5 mmol·L-1Cd處理使幼苗根和莖中的MDA含量均分別達(dá)到了最大值，相比于CK分別增加了117.06%和318.35%(P<0.05)。幼苗葉中MDA含量的最大值在Cd處理濃度為2.0 mmol·L-1時出現(xiàn)，相比于CK增加了732.57%(P<0.05)，升值幅度明顯高于根和莖(圖3:B)。

REC可以用來表示電解質(zhì)滲透率的變化，而電解質(zhì)滲透率的變化可直接反映出細(xì)胞膜透性的改變以及細(xì)胞被破壞情況(陳鈺等，2007)。不同濃度的Cd處理顯著提高了紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的REC(P<0.05)。其中，1.0 mmol·L-1Cd處理使幼苗根和莖中的REC分別達(dá)到了最大值，相比于CK分別增加了72.33%和73.19%(P<0.05)。幼苗葉中REC隨著Cd處理濃度的增加而持續(xù)升高，在2.0 mmol·L-1時達(dá)最大，相比于CK增加了210.28%(P<0.05)。此外，幼苗的REC為根>莖>葉，而升值幅度則是葉顯著高于根和莖(P<0.05)(圖3:D)。

2.3 Cd脅迫對幼苗根系活力的影響

根系活力是評價植物根系的吸收、合成、氧化和還原等能力的一項(xiàng)生理指標(biāo)，可客觀地反映植株生命代謝活動(何俊瑜等，2009)。隨著Cd處理濃度的增加，紫花苜蓿幼苗根系活力呈明顯的先增強(qiáng)后減弱趨勢(P<0.05)，低濃度Cd處理使根系活力增強(qiáng)，0.25 mmol·L-1處理使根系活力達(dá)最強(qiáng)，相比CK增加了36.94%(P<0.05)。高濃度Cd處理使根系活力減弱，2.0 mmol·L-1Cd處理下，根系活力僅為CK的55.42%(P<0.05)(圖4)。

圖 4 Cd脅迫對紫花苜蓿幼苗根系活力的影響Fig. 4 Effects of Cd on root activity in alfalfa seedlings

2.4 Cd脅迫下幼苗內(nèi)源NO和ROS生成的相關(guān)性及逐步回歸分析

根中NO含量與NOS、NR及NO2-正相關(guān)(P>0.05)，表明NOS、NR和NO2-在根內(nèi)NO生成過程中起作用。莖中NO含量與NOS、NR極顯著正相關(guān)(P<0.001)，說明NOS、NR是影響幼苗莖中NO含量的主要因素；與NO2-、Car正相關(guān)，說明NO2-、Car促進(jìn)了莖中NO的生成。而葉中NO含量與NOS極顯著正相關(guān)(P<0.001)，與NO2-較顯著正相關(guān)(P<0.01)，與NR顯著正相關(guān) (P<0.05)，與Car正相關(guān)，說明NOS、NO2-和NR則是影響葉中NO含量的主要因素。逐步回歸分析結(jié)果如下。

根：Y=375.333+11.756X1+254.14X3

r1=0.41730,r3=0.39904

莖：Y=187.997+35.700X1+17.050X2

r1=0.67443,r2=0.82804

葉：Y=818.423+43.62X1+3.019X2+129.415X3

r1=0.41730,r2=0.17874,r3=0.39904

式中，Y為NO含量，X1為NOS，X2為NR，X3為NO2-，r為相關(guān)系數(shù)。逐步回歸分析與相關(guān)性分析結(jié)果相同(表1)。

根：Y=428.608+7.815X1+11.405X3

r1=0.23040,r3=0.34069

莖：Y=493.098+16.939X1+42.875X3

r1=0.45058,r3=0.54518

葉：Y=1366.775-19.715X2+14.538X3-6.030X4

r2=-0.3719,r3=0.28211,r4=-0.4125

3 討論

NO廣泛參與了植物對逆境脅迫的響應(yīng)，而響應(yīng)特征可由內(nèi)源NO含量的變化規(guī)律反映(陳娟等，2009)。本研究結(jié)果顯示低濃度的Cd處理使紫花苜蓿幼苗根、莖和葉中的NO含量顯著升高，說明此時NO正充當(dāng)活躍的信號分子引發(fā)相關(guān)生理反應(yīng)以保護(hù)植物(邵小杰和楊洪強(qiáng)， 2010)。已有研究表明高濃度Cd會顯著降低植株中NO產(chǎn)生量(林嘯等，2014；邵小杰和楊洪強(qiáng)， 2010)，但在本研究中，高濃度的Cd處理下幼苗中的NO含量雖逐漸降低，但仍維持略高或持平于CK的水平，這也可能是由于Cd的積累破壞了NO清除機(jī)制(Barroso et al，2006)，類似的變化在大麥幼苗中也曾出現(xiàn)(陳娟等，2009)。

NO的產(chǎn)生主要可分以為酶促和非酶促反應(yīng)(Beligni & Lamattina，2000)。NOS和NR是酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶。逐步回歸分析顯示，NOS和NR是影響莖中NO含量的主要因素；NOS、NO2-和NR則是影響葉中NO含量的主要因素，而根中NO含量主要與NOS活性和NO2-含量有較大的相關(guān)性。NR催化合成NO需要在較高的NO2-條件下進(jìn)行(Morot-Gaudry-Talarmain et al，2002)；而本研究結(jié)果表明，NR活性的升高都在NO2-含量增加之后，這也符合NR途徑作用產(chǎn)生NO的規(guī)律。當(dāng)Cd濃度達(dá)到0.5 mmol·L-1時，Car含量突然下降，下降趨勢較陡，說明濃度高于0.5 mmol·L-1的Cd處理對紫花苜蓿幼苗有明顯損傷，對NO的合成作用也較弱；而莖中Car含量走勢相對較為平緩，說明Cd脅迫對莖中Car含量的影響不顯著。整體而言，Cd脅迫會極大地抑制Car的合成，這與翟晶(2013)對楊樹幼苗的研究結(jié)果相一致。

表 1 Cd脅迫下紫花苜蓿幼苗內(nèi)源一氧化氮和活性氧生成的相關(guān)性

注： * 表示不同指標(biāo)間相關(guān)性顯著(P<0.05)，**表示不同指標(biāo)間相關(guān)性較顯著(P<0.01)，***表示不同指標(biāo)間相關(guān)性極顯著(P<0.001)。

Note:*, **, and *** indicate significant differences atP<0.05,P<0.01 andP<0.001, respectively.

本研究結(jié)果表明，低濃度Cd脅迫在加劇紫花苜蓿幼苗膜脂過氧化的同時，也促進(jìn)了根系活力的提高，說明此時幼苗代謝旺盛，這也可能是植物的一種應(yīng)激反應(yīng)。低濃度的Cd可以刺激細(xì)胞抗性蛋白的產(chǎn)生和激活抗氧化系統(tǒng)，加速一些生理生化反應(yīng)(邵小杰和楊洪強(qiáng)， 2010)。但高濃度的Cd會造成ROS的產(chǎn)生與清除能力失衡，造成自由基的大量累積，從而引發(fā)植株膜脂過氧化作用(慈敦偉等，2009)。逐步回歸分析的結(jié)果表明，根系活力與ROS生成的各指標(biāo)基本呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，表明高濃度的Cd處理使得ROS生成的各指標(biāo)急劇上升，而根系活力卻持續(xù)下降，也證明了此時細(xì)胞已受嚴(yán)重傷害。

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Effects of endogenous NO and ROS generation in alfalfa under Cd stress

QU Miao-Miao, CHEN Yin-Ping*, SU Xiang-Nan, NGABIRE Maurice,YANG Bo, KE Yun-Qi, MUKUNDWA Anne Marie

( School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China )

cadmium stress， alfalfa (Medicogosativa)， nitric oxide， reactive oxygen species

10.11931/guihaia.gxzw201603001

2016-03-01

2016-05-25

國家自然科學(xué)基金(31260089，31560161，31170413)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31260089，31560161，31170413)]。

蘧苗苗(1991-)，女，浙江溫州人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)學(xué)，(E-mail)qu.m.m@qq.com。

*通訊作者： 陳銀萍，博士，教授，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)學(xué),(E-mail)yinpch@mail.lzjtu.cn。

Q945

A

1000-3142(2016)12-1483-10

蘧苗苗， 陳銀萍， 蘇向楠， 等. 鎘脅迫下紫花苜蓿幼苗內(nèi)源一氧化氮和活性氧的生成 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1483-1491

QU MM, CHEN YP, SU XN， et al. Effects of endogenous NO and ROS generation in alfalfa under Cd stress [J]. Guihaia， 2016， 36(12):1483-1491