王艷，楊榮萍，張旻威，洪明偉，李松開，張賽賽，井銳銳，姜勤，李文祥

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省蒙自市果疏技術(shù)推廣站，云南 蒙自 661100；3.云南省通?？h經(jīng)濟(jì)作物工作站，云南 通海 652700)

5個(gè)石榴品種雜交F1代分析研究初探*

王艷1，楊榮萍1，張旻威1，洪明偉1，李松開2，張賽賽1，井銳銳1，姜勤3，李文祥1

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省蒙自市果疏技術(shù)推廣站，云南 蒙自 661100；3.云南省通海縣經(jīng)濟(jì)作物工作站，云南 通海 652700)

為探討軟籽石榴雜交后代生活力較低的原因，以6年生河南突尼斯軟籽石榴、云南建水紅珍珠石榴和云南建水紅瑪瑙石榴為父本，云南甜光顏石榴和云南甜綠籽石榴為母本，設(shè)計(jì)6個(gè)雜交組合進(jìn)行雜交授粉。結(jié)果表明，得到雜交F1代種子，其中雜交組合①河南突尼斯軟籽石榴♂×云南蒙自甜光顏石榴♀和⑤云南建水紅珍珠石榴♂×云南蒙自甜綠籽石榴♀的坐果率較高，分別為65%和57%，出現(xiàn)雜交親和性，并具有親本優(yōu)勢(shì)，可培育出F1代實(shí)生苗木，從而培育新的石榴品種資源。

石榴；雜交F1代；胚活性；坐果率

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科(Punicaceae)(安石榴科)石榴屬(Punica)落葉灌木或小喬木植物[1]。自20世紀(jì)70年代以來，中國(guó)石榴研究的開展越來越多，對(duì)國(guó)內(nèi)石榴資源進(jìn)行了調(diào)查、收集、分類等諸多研究工作。初步調(diào)查得到中國(guó)南北各地現(xiàn)有品種資源150多個(gè)，其中結(jié)實(shí)品種140多個(gè)[2]。全國(guó)著名的產(chǎn)地有：山東的棗莊、陜西的臨潼、新疆的葉城、安徽的懷遠(yuǎn)、云南的巧家、蒙自、建水、祿豐和四川的會(huì)理等地[3]。并通過長(zhǎng)期的人工栽培和馴化得到6個(gè)變種：白石榴、紅石榴(四瓣石榴)、重瓣石榴、月季石榴(四季石榴)、墨石榴和彩花石榴(瑪瑙石榴)[4～7]。近幾年雜交育種的相關(guān)研究得到重視，雜交可以使雙親的基因重新組合，形成各種不同的類型，為選擇提供豐富的材料；基因重組可以將雙親控制不同性狀的優(yōu)良基因結(jié)合于一體，或?qū)㈦p親中控制同一性狀的不同微效基因積累起來，產(chǎn)生在各該性狀上超過親本的類型。而在石榴栽培生產(chǎn)中，常用扦插、分株、壓條進(jìn)行繁殖，雖然可以保留品種的優(yōu)良特性，但是對(duì)新品種的發(fā)現(xiàn)，有關(guān)石榴種質(zhì)創(chuàng)新方面的研究較少[8～9]。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)雜交組合進(jìn)行雜交授粉，測(cè)定種子活性及出苗率，觀察石榴雜交授粉后實(shí)生苗木的優(yōu)良特性，為培育新的石榴品種資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在云南省蒙自市草壩果樹示范園進(jìn)行。試驗(yàn)地位于云南省紅河州蒙自縣西北部，103°23′E,23°23′N，海拔1 260m。屬于南亞熱帶氣候類型，年均日照2 334h，日照率51%，全年≥10℃積溫6 255℃，無霜期337天，年平均溫度18.8℃。地勢(shì)東南高、西北低，東以犁耙山為屏障，南、北、西三面為丘陵環(huán)繞，具有良好的石榴栽培條件。蒙自市的石榴栽培主要分布在新安所、文瀾、草壩和雨過鋪4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，主栽品種為甜綠籽石榴、甜光顏石榴、厚皮甜砂籽石榴3個(gè)。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選擇6年生的5個(gè)石榴品種，以河南突尼斯軟籽石榴、云南建水紅珍珠石榴和云南建水紅瑪瑙石榴為父本，云南蒙自甜光顏石榴和云南蒙自甜綠籽石榴為母本。河南突尼斯石榴為軟籽石榴品種，果粒深紫色，花紅色。云南建水紅珍珠石榴和云南建水紅瑪瑙石榴為酸甜半軟籽石榴品種，果粒鮮紅色，花紅色。云南蒙自甜光顏石榴和云南蒙自甜綠籽石榴，為半軟籽石榴品種，果粒淺粉紅色，花紅色[10]。選擇樹體健壯，生長(zhǎng)勢(shì)好，花期接近，并且花粉活性高，單果較重，果皮色澤鮮艷(主要為紅色)的石榴品種。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)6 個(gè)雜交處理 ①河南突尼斯軟籽石榴♂×云南蒙自甜光顏石榴♀;②河南突尼斯軟籽石榴♂×云南蒙自甜綠籽石榴♀;③云南建水紅珍珠石榴♂×云南蒙自甜光顏石榴♀;④云南建水紅瑪瑙石榴♂×云南蒙自甜光顏石榴♀;⑤云南建水紅珍珠石榴♂×云南蒙自甜綠籽石榴♀;⑥云南建水紅瑪瑙石榴♂×云南蒙自甜綠籽石榴♀。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 雜交試驗(yàn)

于2015年3月20日蒙自縣甜綠籽石榴和甜光顏石榴開花初期(5%的花朵開放)，在每個(gè)品種的2株樹上選取花序數(shù)較多的4個(gè)主枝進(jìn)行標(biāo)記，摘掉開放的花朵，每個(gè)主枝保留10朵沒開放的花朵，去雄蕊進(jìn)行人工授粉后套袋。

(1)去雄、授粉、套袋 授粉時(shí)間選擇晴天上午7：00-10：00，采集父本未完全開放的花朵，取其花粉。在母本中選擇10朵未開放花朵，用鋒利小刀縱切并輕輕打開花冠，割掉雄蕊，用毛筆蘸取培養(yǎng)皿中父本石榴花粉，授于母本柱頭上，觸碰4～5次，授粉結(jié)束立即套袋[11]。同時(shí)，在同株母本上選擇10朵未開花朵進(jìn)行自然授粉，掛吊牌記錄，不作任何處理。授粉15～30天后，去袋即可。

(2)花粉活力測(cè)定、胚活力測(cè)定-TTC染色法 采集父母本的花朵，測(cè)定其花粉活性。分別取少量花粉放在載玻片上，滴1～2滴TTC溶液，用鑷子將其攪拌均勻，蓋上蓋玻片，并將此玻片置于35～40℃下培養(yǎng)15～20min。凡被染成紅色的花粉均表示其具有生活力[12]。在顯微鏡下觀察3個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算花粉生活力[13～14]。其計(jì)算公式為，花粉活力=視野內(nèi)被染色的花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。

采集6個(gè)雜交組合的果實(shí)獲得種子及親代，測(cè)定胚活力。將種子浸泡24h后，沿胚軸線切開，同樣采用TTC染色法進(jìn)行染色，凡被染成紅色的種胚均表示其具有生活力。在顯微鏡下觀察3個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算種胚生活力[15]。其計(jì)算公式為，胚活力=視野內(nèi)被染色的種胚數(shù)/種胚總數(shù)×100%。

1.4.2 坐果率測(cè)定

坐果率為果樹上結(jié)果數(shù)占開花總數(shù)的百分率[16]。到9月中旬果實(shí)成熟后，測(cè)定坐果率。其計(jì)算公式為，坐果率=果樹結(jié)實(shí)數(shù)/開花數(shù)×100%。

1.4.3 子代測(cè)定

(1)催芽與實(shí)生苗繁育 將浸泡過24h的種子，先瀝去或晾干種皮上多余的水，使種皮成濕潤(rùn)狀，然后用熱水燙過的紗布包起種子。將種子放于20～30℃的恒溫箱中進(jìn)行催芽。種子露白后即可播種?；|(zhì)由珍珠巖與草炭按2︰5的比例混配[17]。1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)實(shí)生苗出苗率。其計(jì)算公式為，出苗率=出苗數(shù)/播種數(shù)×100%。

(2)石榴種子形態(tài)測(cè)定 用游標(biāo)卡尺測(cè)量石榴種子的長(zhǎng)度、寬度、厚度和種皮厚度，每個(gè)處理測(cè)定10粒種子，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方差。將石榴種子浸泡24h后，沿種縫線切開，在體視鏡下觀察、拍照。種子大小參照劉長(zhǎng)江的方法[18]進(jìn)行觀察描述；種子形狀和顏色主要參照“CMYK印刷專用精選色譜”[19]方法進(jìn)行觀察描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本的花特征及花粉活力

石榴完全花為兩性花，一般1朵至數(shù)朵著生在當(dāng)年新梢頂端及項(xiàng)端以下的葉腋間；萼片硬，肉質(zhì)，管狀，5～7裂，與子房連生；花瓣倒卵形，與萼片同數(shù)而互生，覆瓦狀排列?；ǘ浞譃閱伟旰椭匕闧20]，重瓣品種雌雄蕊多瓣花而不孕，花瓣多達(dá)數(shù)十枚；花多紅色，也有白色和黃、粉紅、瑪瑙等色。雄蕊多數(shù)，花絲無毛。雌蕊具花柱1個(gè)，長(zhǎng)度超過雄蕊?；ǚ凼欠N子植物花粉粒的總稱，含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)，如淀粉、葡萄糖、果糖、維生素和酶等。花粉保存于溫度0～5℃且黑暗條件下為宜。

通過花粉活力、胚活力的測(cè)定可以了解種子的可育性[21～22]，并掌握不育花粉的形態(tài)和生理特征，進(jìn)行雜交技術(shù)的改良。因此通過測(cè)定5個(gè)親本的花粉活力，預(yù)測(cè)授粉情況。由表1得出，5個(gè)親本的花粉活力都較高，其中作為父本的紅珍珠、紅瑪瑙和突尼斯的花粉活力分別為84.66%、87.15%和89.14%，可保證授粉試驗(yàn)的順利進(jìn)行。在授粉時(shí)將作為母本的甜綠籽和甜光顏的雄蕊處理干凈。

表1 5個(gè)雜交親本的花粉活力

2.2 5個(gè)雜交F1代與親本相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定

果樹開花結(jié)果過程中，常因授粉受精不完全，外界環(huán)境條件不良和栽培管理不當(dāng)?shù)仍蚨鹇浠涔?，使坐果率較低[23～26]。通過測(cè)定雜交果實(shí)和親本果實(shí)的生理指標(biāo)(可溶性糖、果形指數(shù))，得出雜交果實(shí)的不同特點(diǎn)。

實(shí)生苗是直接由種子繁殖的苗木，具有生長(zhǎng)旺盛、根系發(fā)達(dá)、壽命較長(zhǎng)等特點(diǎn)；用作繁殖材料時(shí)來源豐富，方法簡(jiǎn)便，成本低廉。因而實(shí)生繁殖迄今仍是植物栽培中最主要的育苗方法。在雜交育種中，也需要利用雜種實(shí)生苗后代分離的特性來選育新品種[27]。

表2 雜交種與親本的主要性狀

由表2得出，雜交設(shè)計(jì)①、③、⑤的果肉顏色，出現(xiàn)父本性狀；④的果粒數(shù)增多；⑤、⑥的果形指數(shù)增大。雜交種總體坐果率較低，①、⑤坐果率最高，在50%以上，分別為65%和57%。同時(shí)雜交種的胚活力增強(qiáng)，用與親本同樣方法催芽，出芽較快，可獲得高出苗率的實(shí)生苗。結(jié)果表明，雜交種可以保留親本的優(yōu)良特性，提高種子的配合力，并為F2代雜交育種奠定基礎(chǔ)。

2.3 雜交組合方差分析

對(duì)6個(gè)雜交處理進(jìn)行方差分析[28]可知(見表3和表4)，在95%和99%置信水平下雜交組合①與⑤均不顯著，而與②、③、④、⑥均有顯著性，坐果率達(dá)到65%，相比其他組合具有較高的坐果率。在99%的置信水平下，雜交組合①平均坐果率顯著高于②、③、④；在95%置信水平雜交組合②與⑥顯著高于①與⑤，③、④、⑥之間差異不顯著，其中③的坐果率最低，僅為20%。

表3 雜交組合間坐果率的方差分析

表4 雜交組合間的多重比較

2.4 種子的形態(tài)特點(diǎn)

各品種及雜交種的種子形態(tài)特征測(cè)量結(jié)果見表5、圖1和圖2。親本與雜交品種的種子形狀、種皮顏色、種胚顏色和種子的長(zhǎng)、寬、厚差異均不明顯，而種皮厚度差異明顯。雜交處理④紅瑪瑙♂×甜光顏色的種皮厚度數(shù)值最低，為0.031±0.008。紅瑪瑙和紅珍珠種皮較硬，雜交種和甜光顏、甜綠籽適中，突尼斯品種最軟。

根據(jù)楊萬林的石榴籽粒硬度測(cè)定結(jié)果[29]，以及本試驗(yàn)測(cè)量的種皮厚度，可以得出突尼斯石榴為軟籽石榴品種，甜綠籽、紅光顏、紅珍珠、紅瑪瑙4個(gè)石榴品種為半軟籽石榴品種。6個(gè)雜交種處于軟籽與半軟籽之間，可作為新品種進(jìn)行進(jìn)一步培育。

表5 種子形態(tài)特征測(cè)定

1234567891011

圖1 親本與雜交種果粒顏色對(duì)比

圖2 種子形態(tài)特征

注：1為月季石榴;2為突尼斯;3為甜光顏;4為紅珍珠;5為甜綠籽;6為云南建水紅瑪瑙♂x云南甜綠籽♀;7為云南建水紅瑪瑙石榴♂×云南甜光顏♀;8為紅瑪瑙;9為云南建水紅珍珠石榴♂×云南甜光顏♀;10為云南建水紅珍珠石榴♂×云南甜綠籽♀;11為河南突尼斯軟籽石榴♂×云南甜光顏♀;12為河南突尼斯軟籽石榴♂×云南甜綠籽♀

Fig.2 Morphological characteristics of different seeds

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)得出雜交F1代種子的配合力都在40%以上，有利于下一步進(jìn)行實(shí)生苗繁殖，培育新品種。并且，雜交F1的果實(shí)出現(xiàn)親本優(yōu)勢(shì)，①、②、③3個(gè)雜交處理的果肉顏色加深，均出現(xiàn)父本的優(yōu)良性狀(說明花粉直感作用明顯)。在6個(gè)處理的坐果率方差分析中，處理⑤和①分別為57%和65%，表現(xiàn)最為顯著，顯著高于處理組合③、④和⑥。

試驗(yàn)以河南突尼斯軟籽石榴、云南建水紅珍珠和云南建水紅瑪瑙石榴為父本，云南蒙自甜光顏石和云南蒙自甜綠籽石榴為母本，是根據(jù)南北方不同石榴品種、云南省酸甜不同口感石榴品種進(jìn)行雜交，得到的是F1代雜交種，通過對(duì)F1代進(jìn)行大量的實(shí)生苗種植，從中篩選優(yōu)良性狀進(jìn)行培養(yǎng)，有望得出綜合了親本優(yōu)良性狀的新品種。

然而研究結(jié)果應(yīng)用有限，對(duì)于其他石榴品種做母本的雜交育種，必須要對(duì)相關(guān)品種進(jìn)行試驗(yàn)研究。同時(shí)，在此雜交試驗(yàn)中，6個(gè)雜交處理的坐果率偏低，需要進(jìn)一步調(diào)查花瓣、自體雄蕊和套袋對(duì)雜交結(jié)實(shí)的影響。

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F1 Generation Cross Seeding of FivePunicagranatumL.Cultivars

WANG Yan1,YANG Rong-ping1,ZHANG Min-wei1,HONG Ming-wei1,LI Song-kai2,ZHANG Sai-sai1,JING Rui-rui1,JIANG qin3,LI Wen-xiang1

(1.The College of Horticulture and Landscape in Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;2.The Horticulture Station of Mengzi City Yunnan Province,Mengzi Yunnan 661100,P.R.China;3.The Horticulture Station of Tonghai City Yunnan Province,Tonghai Yunnan 652700,P.R.China)

To understand the low survival rate of hybrid generation,hybridization pollination among 6 different pomegranate cultivars was conducted by selecting 6-year-old Tunisia pomegranate from Henan Province,pink pearl pomegranate and onyx pomegranate from Yunnan Province as male parent,Tianguangyan pomegranate and Tianlvzi pomegranate of Yunnan province as female parent.The results showed that the F1 hybrid generation ①Henan Tunisia soft seeds pomegranate♂×Yunnan Tianguangyan ♀ and ⑤Yunnan Jianshui sweet pink pearl pomegranate♂×Yunnan Tianlvzi♀ could higher fruit production compared with other combinations,namely 65% and 57% respectively.These two combinations also showed hybrid affinity with their parents,therefore they could produce the F1 seedlings,and cultivate new varieties of pomegranate resources.

PunicagranatumL.;F1 hybrid generation; seed vigor; fruit setting rate

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.013

2016-01-21

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第七屆學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動(dòng)基金項(xiàng)目(2014ZKX041)。

王艷(1990-)，女，碩士研究生，主要從事果樹栽培生理研究。E-mail：13592640758@163.com

簡(jiǎn)介： 李文祥(1959-)，男，教授，主要從事果樹生理及栽培方面的教學(xué)和科研工作。

E-mail:liwenxiang1959@sina.com

S 665.4

A

1672-8246(2016)06-0073-06