胡 艷 李 環(huán) 古漪玲 魏蔚霞 吳瑞芳

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科 深圳市婦科腫瘤醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，深圳 518036)

·實(shí)驗(yàn)研究·

P物質(zhì)在子宮內(nèi)膜異位癥所致慢性盆腔疼痛患者子宮骶韌帶中的表達(dá)*

胡 艷 李 環(huán) 古漪玲 魏蔚霞 吳瑞芳**

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科 深圳市婦科腫瘤醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，深圳 518036)

目的 探討P物質(zhì)在子宮內(nèi)膜異位癥所致慢性盆腔痛患者子宮骶韌帶中的表達(dá)。 方法 選擇2013年6月～2014年12月26例因子宮內(nèi)膜異位癥所致慢性盆腔疼痛擬行手術(shù)治療的患者為研究組，同期因婦科疾病需行子宮切除術(shù)且無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥和慢性盆腔痛的33例患者為對(duì)照組。術(shù)中取骶韌帶組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及免疫組化SP法檢測(cè)P物質(zhì)mRNA和蛋白在2組骶韌帶中的相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果 研究組骶韌帶中P物質(zhì)mRNA的相對(duì)表達(dá)量(中位數(shù)0.2129，四分位數(shù)間距0.6954)和蛋白的陽(yáng)性面積百分比(25.6531%±7.0761%)明顯高于對(duì)照組(中位數(shù)0.0364，四分位數(shù)間距0.1674，20.2915%±4.3665%)(Z=-2.141，P=0.032；t=3.614，P=0.001)。 結(jié)論 子宮內(nèi)膜異位癥所致慢性盆腔痛患者子宮骶韌帶中P物質(zhì)mRNA的相對(duì)表達(dá)量和蛋白的陽(yáng)性面積百分比均較無(wú)慢性盆腔痛患者高，提示子宮骶韌帶中P物質(zhì)表達(dá)增加可能是子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致慢性盆腔痛的原因。

P物質(zhì); 慢性盆腔痛; 子宮內(nèi)膜異位癥

慢性盆腔疼痛(chronic pelvic pain，CPP)是由各種功能性或器質(zhì)性原因引起的非周期性以骨盆及其周?chē)M織疼痛為主要癥狀，時(shí)間超過(guò)6個(gè)月的需要藥物或手術(shù)治療的一組疾病或綜合征。其病因復(fù)雜，涉及生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、肌肉骨骼系統(tǒng)和心理疾患等方面，其中子宮內(nèi)膜異位癥是引起CPP最為常見(jiàn)的婦科疾病。目前對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致的慢性盆腔疼痛的治療主要為以抑制雌激素產(chǎn)生和降低雌激素水平為目的的藥物治療，以及腹腔鏡異位種植病灶切除的手術(shù)治療。無(wú)論是藥物、手術(shù)或手術(shù)聯(lián)合藥物治療，疼痛都能有不同程度的緩解，但是部分患者容易復(fù)發(fā)[1,2]，治療效果不甚滿(mǎn)意。因此，重視子宮內(nèi)膜異位癥所致CPP的發(fā)病機(jī)理研究，從病因?qū)W研究找到疾病的根本性治療方法非常重要。疼痛是傷害性刺激作用于機(jī)體引起的一種復(fù)雜的心理生理學(xué)過(guò)程，是一種不愉快的主觀感受；神經(jīng)纖維末梢、神經(jīng)遞質(zhì)和傷害性刺激是疼痛產(chǎn)生的必備條件。P物質(zhì)是疼痛產(chǎn)生過(guò)程中的致痛神經(jīng)遞質(zhì)，本研究采用免疫組化SP法和熒光定量PCR法研究P物質(zhì)在子宮內(nèi)膜異位癥所致CPP患者子宮骶韌帶中的表達(dá)，探討P物質(zhì)與子宮內(nèi)膜異位癥致慢性盆腔痛的關(guān)系，為治療子宮內(nèi)膜異位癥致慢性盆腔痛提供理論依據(jù)。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

本研究病例選擇和組織提取均征得患者知情同意并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。研究組選取2013年6月～2014年12月因子宮內(nèi)膜異位癥致慢性盆腔疼痛擬行開(kāi)腹或腹腔鏡手術(shù)治療的26例，年齡41～50歲，有慢性盆腔痛病史，近3個(gè)月內(nèi)未使用孕激素類(lèi)和促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)等藥物，無(wú)盆腔手術(shù)史，且術(shù)中骶韌帶可見(jiàn)內(nèi)膜異位癥病灶或骶韌帶組織病理檢查見(jiàn)內(nèi)膜異位癥病灶。對(duì)照組選擇同期因?yàn)閷m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)、早期宮頸癌、子宮肌瘤等擬行開(kāi)腹或腹腔鏡子宮切除術(shù)的33例，年齡41～51歲，無(wú)慢性盆腔痛等相關(guān)疾病，近3個(gè)月未使用孕激素和GnRH-a等藥物，無(wú)盆腔手術(shù)史，術(shù)中骶韌帶未發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥病灶且骶韌帶的組織病理檢查未見(jiàn)子宮內(nèi)膜異位癥病灶。研究組年齡(46.1±2.6)歲，對(duì)照組(46.2±2.8)歲，差異無(wú)顯著性(t=-0.094，P=0.925)，具有可比性。

1.2 標(biāo)本的收集與處理

研究組行子宮切除或骶韌帶切斷(或部分切除)手術(shù)，術(shù)中切取含子宮內(nèi)膜異位癥的骶韌帶組織約1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm；對(duì)照組行子宮切除術(shù)時(shí)切取骶韌帶斷端約1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm。所取標(biāo)本1/2置入10%福爾馬林溶液中固定后石蠟包埋，待標(biāo)本收齊后統(tǒng)一4 μm連續(xù)切片用于HE染色和免疫組化；剩余1/2標(biāo)本置入有RNA Later液的EP管內(nèi)并立即置入-80 ℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3 免疫組化SP法

采用免疫組化SP法檢測(cè)骶韌帶中P物質(zhì)的陽(yáng)性面積百分比。P物質(zhì)單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)濃度1∶100；免疫組化SP試劑購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，采用德國(guó)萊卡公司光學(xué)顯微鏡拍照,Image-Pro Plus計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算P物質(zhì)的陽(yáng)性面積百分比，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判讀：采用平均陽(yáng)性染色面積百分比法對(duì)骶韌帶中P物質(zhì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。在光鏡下觀察所有染色切片，P物質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，陽(yáng)性顆粒表達(dá)位于細(xì)胞漿內(nèi)及細(xì)胞膜上。每張切片隨意選取5個(gè)完整而不互相重復(fù)的×200視野，拍照后用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算5個(gè)視野P物質(zhì)陽(yáng)性面積平均百分比，得出P物質(zhì)蛋白的陽(yáng)性面積百分比。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA，總反應(yīng)體系為10 μl，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法使用Lightcycler480型熒光定量PCR儀，總反應(yīng)體系20 μl，cDNA模板1 μl，SYBR Premix預(yù)混緩沖液10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，加滅菌水至20 μl。各引物序列見(jiàn)表1。按照各目的基因退火溫度選擇三步法完成擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)40。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔保證重復(fù)率，重復(fù)2次。根據(jù)高分辨率熔解曲線判斷實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。骶韌帶中P物質(zhì)mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔCt法計(jì)算；其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。

表1 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

研究組骶韌帶內(nèi)可見(jiàn)子宮內(nèi)膜異位癥(圖1)，2組骶韌帶中均有P物質(zhì)表達(dá)(圖2)；內(nèi)參GAPDH及P物質(zhì)的擴(kuò)增曲線有指數(shù)擴(kuò)增期，有平臺(tái)期，并且曲線起峰均<40Ct，整條曲線光滑(圖3)；熔解曲線峰值單一，無(wú)雜峰、雙峰或引物二聚體峰信號(hào)，內(nèi)參GAPDH與P物質(zhì)的熔解溫度分別為86 ℃和83 ℃(圖4)，表明逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及引物的特異度均較好，反應(yīng)條件選擇適當(dāng)。研究組骶韌帶中P物質(zhì)蛋白的陽(yáng)性面積百分比和P物質(zhì)mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 子宮骶韌帶中子宮內(nèi)膜異位癥病灶(HE染色，×100) 圖2 P物質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)(SP染色，×200) 圖3 內(nèi)參GAPDH和P物質(zhì)擴(kuò)增曲線 圖4 內(nèi)參GAPDH和P物質(zhì)高分辨率熔解曲線

表2 子宮骶韌帶中P物質(zhì)mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性面積百分比

組別mRNA相對(duì)表達(dá)量(M,Q3-Q1)蛋白陽(yáng)性面積百分比(%)(x±s)研究組(n=26)0.2129,0.695425.6531±7.0761對(duì)照組(n=33)0.0364,0.167420.2915±4.3665Z(t)值Z=-2.141t=3.614P值0.0320.001

3 討論

不同人群中CPP患病率從2.1%～26.6%不等[3]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且診療困難，CPP已經(jīng)成為世界性的健康問(wèn)題[4]。很多婦科疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、慢性盆腔炎、盆腔粘連、子宮肌瘤、盆腔充血綜合征以及婦科手術(shù)等[5,6]都可能導(dǎo)致CPP，其中子宮內(nèi)膜異位癥是引起CPP最為常見(jiàn)的婦科疾病[7]，半數(shù)以上出現(xiàn)CPP癥狀的女性患者患有子宮內(nèi)膜異位癥，大部分的子宮內(nèi)膜異位癥患者有CPP[8,9]，兩者關(guān)系密切。研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥致CPP的發(fā)生與病變嚴(yán)重程度和病變部位有密切關(guān)系[10，11]，骶韌帶內(nèi)含有豐富的神經(jīng)末梢，當(dāng)子宮內(nèi)膜異位病灶浸潤(rùn)子宮骶韌帶時(shí)，骶韌帶的攣縮、粘連和增粗，引起各種疼痛，CPP最常見(jiàn)[12,13]，在各種炎性細(xì)胞刺激因子作用下，神經(jīng)末梢敏感性增強(qiáng)，反復(fù)作用使疼痛進(jìn)行性加重[14]。

疼痛是由實(shí)質(zhì)上或潛在的組織損傷引起的不愉快的感覺(jué)，神經(jīng)纖維末梢、神經(jīng)遞質(zhì)和傷害性刺激是產(chǎn)生疼痛的必備條件。P物質(zhì)是由11個(gè)氨基酸組成的多肽，廣泛分布于中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)及組織器官。其分布部位及作用方式不同，起著神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)或激素樣作用。

雖然子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致疼痛的發(fā)生機(jī)制至今尚不清楚，但目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥疼痛是一種傷害性、炎癥性以及神經(jīng)源性綜合的復(fù)雜性疼痛。因此，我們觀察P物質(zhì)在子宮內(nèi)膜異位癥所致CPP患者骶韌帶中的表達(dá)，探討骶韌帶中P物質(zhì)的表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥致CPP的關(guān)系。Tokushige等[15]提出子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜、子宮肌層神經(jīng)纖維密度增加與盆腔疼痛癥狀有關(guān)，同時(shí)，子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜功能層分布高密度感覺(jué)神經(jīng)C纖維，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥疼痛及痛覺(jué)過(guò)敏起重要作用。因此，越來(lái)越多的學(xué)者從神經(jīng)肽類(lèi)相關(guān)因子如P物質(zhì)角度研究子宮內(nèi)膜異位癥疼痛的機(jī)理，夏平等[16]的研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜亦見(jiàn)少量P物質(zhì)神經(jīng)纖維分布，P物質(zhì)在子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠中的含量高于非模型組，從而證明子宮內(nèi)膜異位癥疼痛與P物質(zhì)含量增加有關(guān)，推測(cè)高水平的P物質(zhì)可能促使子宮內(nèi)膜異位癥疼痛的發(fā)生。本研究的結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥致CPP患者骶韌帶中P物質(zhì)mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于無(wú)CPP患者，提示骶韌帶中P物質(zhì)表達(dá)增加可能是子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致CPP的原因。骶韌帶中P物質(zhì)表達(dá)的增加導(dǎo)致CPP主要與P物質(zhì)傳遞痛和P物質(zhì)致痛有關(guān)。在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中，P物質(zhì)主要由一級(jí)傳入神經(jīng)元胞體合成，儲(chǔ)存于突觸小泡內(nèi)，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳遞時(shí)引發(fā)離子通道開(kāi)放，外鈣內(nèi)流，促使囊泡與突觸前膜融合并釋放，P物質(zhì)再通過(guò)軸流轉(zhuǎn)運(yùn)到初級(jí)傳入神經(jīng)末梢，發(fā)揮傳導(dǎo)痛覺(jué)的作用[17]。此外，在多種慢性疼痛中，P物質(zhì)作為疼痛遞質(zhì)通過(guò)感覺(jué)神經(jīng)傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞，參與疼痛在脊髓中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制[18]。在組織破壞過(guò)程中或炎癥反應(yīng)中釋放的化學(xué)物質(zhì)(如鉀離子、緩激肽、組織胺以及5-羥色胺)會(huì)使傷害感受器發(fā)生敏化。在此基礎(chǔ)上，傷害感受器自身也會(huì)釋放出痛敏物質(zhì)激活鄰近的傷害感受器，向周?chē)M織擴(kuò)布疼痛和炎癥反應(yīng)，P物質(zhì)是其中的重要成分。因此，P物質(zhì)不僅傳遞傷害性信息，而且參與感受器的作用。Henry等[19]認(rèn)為，大劑量P物質(zhì)可直接引起感覺(jué)神經(jīng)元興奮，導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏，并掩蓋阿片樣物質(zhì)的止痛作用。因此，子宮內(nèi)膜異位癥骶韌帶局部P物質(zhì)表達(dá)的升高不僅能增強(qiáng)傷害性信息的傳遞，而且可直接引起感覺(jué)神經(jīng)元興奮導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏，而敏化的神經(jīng)可釋放大量神經(jīng)遞質(zhì)反過(guò)來(lái)激活肥大細(xì)胞等促使其脫顆粒釋放致痛物質(zhì)，促使神經(jīng)敏化，從而導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的持續(xù)狀態(tài)，即子宮內(nèi)膜異位癥患者的慢性神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致CPP的因素雖然很多，許多情況下并非由單一因素所致，而是由多種因素共同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果提示，子宮內(nèi)膜異位癥致CPP患者骶韌帶中局部P物質(zhì)表達(dá)的增加，推測(cè)P物質(zhì)可能在子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致CPP的發(fā)生中起著重要作用，這對(duì)闡明子宮內(nèi)膜異位癥所致CPP的機(jī)制，探討子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致CPP可能的鎮(zhèn)痛途徑提供理論依據(jù)，對(duì)尋找到新的治療方案有重要意義。但是，局部P物質(zhì)的表達(dá)與CPP發(fā)生發(fā)展是否存在必然的關(guān)聯(lián)及其在CPP的發(fā)生發(fā)展中的作用尚待更多的研究來(lái)證實(shí)，值得我們今后繼續(xù)探索。

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(修回日期：2016-01-23)

(責(zé)任編輯：王惠群)

Expression of Substance P in Patients with Chronic Pelvic Pain Caused by Endometriosis

HuYan,LiHuan,GuYiling,etal.

DepartmentofObstetricsandGynecology,PekingUniversityShenzhenHospital,ShenzhenTechnicalResearchandDevelopmentCenteronGynecologicOncology,Shenzhen518036,China

WuRuifang,E-mail:wurf100@126.com

Objective To investigate the relationship between substance P expression in uterosacral ligament and chronic pelvic pain caused by endometriosis. Methods A group of 26 patients with chronic pelvic pain caused by endometriosis were treated with surgery as the research group, and another 33 patients without chronic pelvic pain and endometriosis were given hysterectomy as the control group. Streptavidin perosidase immunohistochemistry technique was used to evaluate the expression of substance P in uterosacral ligament. Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of substance P in uterosacral ligament. Results The median mRNA relative expressions of substance P were 0.2129 (Q3-Q1=0.6954) in the research group and 0.0364(Q3-Q1=0.1674) in the control group. The percentages of positive staining area of the protein of substance P were 25.6531%±7.0761% in the research group and 20.2915%±4.3665% in the control group. The mRNA relative expressions and the percentage of positive staining area of substance P were significantly higher in the research group than those in the control group (Z=-2.141，P=0.032；t=3.614，P=0.001). Conclusion The increased expressions of substance P in uterosacral ligament of endometriosis patients may be the cause of chronic pelvic pain.

Substance P; Chronic pelvic pain; Endometriosis

2013年廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(項(xiàng)目編號(hào)：A2013609)

A

1009-6604(2016)04-0355-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.04.018

2015-10-21)

**通訊作者，E-mail：wurf100@126.com