李文東, 高乾善,楊鵬 ,楊丙田,王曉*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018; 2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室,山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;3. 濟南森康三峰生物工程有限公司，山東 濟南 250014)

?

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

銀杏葉中銀杏內(nèi)酯提取工藝研究

李文東1,2, 高乾善2,楊鵬3,楊丙田3,王曉2*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018; 2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室,山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;3. 濟南森康三峰生物工程有限公司，山東 濟南 250014)

以銀杏內(nèi)酯(白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C)的提取率為指標，確定銀杏葉乙醇提取的最佳提取工藝。采用正交試驗設(shè)計的方法，系統(tǒng)考察提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)和提取次數(shù)4個因素對銀杏葉提取工藝的影響。以異丙醇為流動相，優(yōu)化高效液相色譜法(HPLC-ELSD)測定銀杏內(nèi)酯的含量，并計算提取率。實驗得出最佳提取工藝條件為提取時間1.5 h、料液比1：20、乙醇體積分數(shù)50%、提取次數(shù)3次。本工藝可以提高銀杏內(nèi)酯的提取率，節(jié)約試驗成本，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

銀杏葉；銀杏內(nèi)酯；正交試驗；提取率；異丙醇

銀杏(GinkgobilobaL.)又名白果、公孫樹、鴨腳子或鴨掌樹，是銀杏科銀杏屬中唯一的生存種屬，被譽為“活化石”。我國自古以來就有銀杏葉入藥和食療的記載，如《本草品匯精要》中提到，銀杏葉“歸肺經(jīng)，能斂肺平喘，益心止痛”。20世紀70年代銀杏葉提取物(extract ofGinkgobiloba, EGb)治療中樞外周血流紊亂和腦血管動脈粥樣硬化的報導(dǎo)出現(xiàn)，其藥用價值受到了更為廣泛的關(guān)注[1-2]。

銀杏葉的化學(xué)成分復(fù)雜，已有報導(dǎo)的成分多達180種[3]，其中主要活性成分為萜類內(nèi)酯化合物(ginkgolides and bilobalides)和黃酮類化合物(flavonoid glycosides)[4]。銀杏內(nèi)酯(ginkgolide)是二萜內(nèi)酯，萜類內(nèi)酯類化合物包括銀杏內(nèi)酯 A、B、C、J 和 M等，均為血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)拮抗劑[5]，可在臨床上用于治療血栓、急性胰腺炎和心血管疾病[6]。白果內(nèi)酯(bilobalide)分子中含有15個碳原子，屬于倍半萜類化合物，具有保護神經(jīng)的作用，對老年癡呆的治療具有良好的效果[7]。目前，從銀杏葉中已分離得到8個萜類內(nèi)酯化合物：銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M、K、L 和白果內(nèi)酯[8-9]。銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。銀杏內(nèi)酯的分子立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成和植物組織培養(yǎng)均受到技術(shù)難度大、生產(chǎn)成本高等因素制約，所以銀杏內(nèi)酯來源以提取銀杏葉為主[10]。在以往的研究中都考慮到銀杏黃酮的提取率，只把銀杏內(nèi)酯作為附帶產(chǎn)品提取，未對銀杏內(nèi)酯提取率影響因素做有針對性的研究[11-13]。在檢測方法方面銀杏內(nèi)酯目前采用高效液相色譜(HPLC)法測定，所用流動相為甲醇-四氫呋喃-水系統(tǒng)，其中四氫呋喃在分析過程中存在價格高、易揮發(fā)和對人有害等缺點[14-17]。本研究確定了從銀杏葉中提取銀杏內(nèi)酯工藝的最佳參數(shù)，提高了銀杏內(nèi)酯的提取效率，同時優(yōu)化的檢測方法使銀杏內(nèi)酯測定更加方便快捷。

圖1 銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of ginkgolides and ginkgo lactone

1 儀器與試劑

KT-300Y型超聲波藥品處理機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent 1260與385-ELSD蒸發(fā)光散射檢測器(美國安捷倫科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KDM型可控調(diào)溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)。銀杏葉(山東雙花制藥有限公司)。銀杏內(nèi)酯標準品(上海生化試劑廠)，其中白果內(nèi)酯(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號110865-201507；銀杏內(nèi)酯A(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號為110862-201511；銀杏內(nèi)酯B(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號110863-201507；銀杏內(nèi)酯C(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號110864-201507。95%乙醇、石油醚和酸性氧化鋁為分析純，甲醇、異丙醇為色譜純。

2 試驗方法

2.1 銀杏內(nèi)酯的分析方法

所有的樣品都用Agilent 1260串聯(lián)385-ELSD檢測器進行檢測，使用YMC-Pack ODS-A( 4.6 mm×250 mm，5 μm) 的色譜柱進行分析，根據(jù)分離度最大(實際測得分離度R>7.2)、檢測時間適宜的要求選用流動相為異丙醇：水(10：90，V/V)，流速為1 mL/min,氣體流速為1.60 L/min (氮氣)，漂移管穩(wěn)定溫度為 90 °C。

2.2 銀杏內(nèi)酯含量測定

稱取銀杏葉樣品量20.0 g，加熱回流，冷卻到室溫用定性濾紙(型號為102)進行過濾，分別回收不同試驗條件下的銀杏內(nèi)酯提取液，濃縮提取液，用甲醇定容到500 mL容量瓶中，室溫超聲30 min，混勻，靜置，取適量樣品用針頭式微孔過濾器濾過0.22 mm有機濾膜后進行高效液相色譜(HPLC-ELSD)檢測，以10%異丙醇為流動相檢測樣品含量(液相色譜圖見圖2)，為確保此方法的準確性，進行精密度試驗以及線性關(guān)系考察。

BB為白果內(nèi)酯;A為銀杏內(nèi)酯A; B為銀杏內(nèi)酯B; C為銀杏內(nèi)酯C a 標準樣品 b 提取樣品圖2 銀杏內(nèi)酯高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of ginkgolides

2.3 分析方法的驗證

2.3.1 線性相關(guān)性

分別精密稱取銀杏內(nèi)酯BB、C、A、B標準樣品17.2、9.3、10.3、8.7 mg，用甲醇分別定容到50 mL，根據(jù)精密稱定樣品的量得到標準品BB、C、A、B溶液濃度分別為0.344 0、0.186 0、0.206 0、0.174 0 mg/mL，通過自動進樣器控制進樣體積得到BB進樣量為0.002 0、0.004 0、0.006 0、0.008 0、0.010 0 mg；C、A、B進樣量為0.001 0、0.002 0、0.003 0、0.004 0、0.005 0 mg；得到樣品進樣量與響應(yīng)值峰面積的對數(shù)的線性相關(guān)性。其相關(guān)性方程及R2見表1。

表1 4種銀杏內(nèi)酯線性方程及R2Table 1 Linear equation of the four ginkgolides and R2

2.3.2 精密度試驗

日間精密度試驗:取上述配制的標準樣品溶液，連續(xù)6 d每天同一時間分別取樣測定4種銀杏內(nèi)酯，得到高效液相色譜響應(yīng)值峰面積,分別計算相對標準偏差。

日內(nèi)精密度試驗：取上述配制的標準樣品溶液，在1 d內(nèi)每隔2 h取一次樣，取6次分別測定樣品，得到高效液相色譜響應(yīng)值峰面積,分別計算相對標準偏差。結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗相對標準偏差Table 2 Accuracy experiment RSD

2.3.3 樣品加樣回收率的測定

精密稱定銀杏內(nèi)酯BB、C、A、B標準樣品5.8、2.6、3.0、4.5 mg，加到上述標準樣品溶液中定容到50 mL容量瓶中，得到0.460 0、0.238 0、0.266 0、0.264 0 mg/mL的溶液，分別取適量樣品進高相液相色譜檢測并重復(fù)3次，得到的回收率平均值為99.2%、98.8%、99.7%、99.6%。以上試驗證明，方法是可靠、準確的。

2.4 銀杏內(nèi)酯的提取率

本試驗以銀杏內(nèi)酯提取率作為指標，選取最佳銀杏葉提取工藝。準確稱取樣品20.0 g，經(jīng)單因素試驗和正交試驗處理樣品，過濾殘渣，濃縮提取液，用甲醇定容到500 mL，進行高效液相色譜檢測，通過2.2中的方法計算銀杏內(nèi)酯含量，計算提取率。銀杏內(nèi)酯包括白果內(nèi)酯(BB)、銀杏內(nèi)酯A(A)、銀杏內(nèi)酯B(B)和銀杏內(nèi)酯C(C)的總和。具體的計算見公式(1)：

(1)

2.5 單因素試驗

主要考察提取次數(shù)、提取時間(h)、乙醇的體積分數(shù)和料液比(g / mL)對銀杏內(nèi)酯提取率的影響，按照2.2方法測定銀杏內(nèi)酯，并計算提取率。

2.6 正交試驗設(shè)計

本研究以銀杏內(nèi)酯提取率為指標，通過加熱回流的方式考察影響含量的主要因素及最佳提取條件，即提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)和提取次數(shù)，選取如下水平進行正交試驗。正交試驗的因素水平見表3。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factor level table of orthogonal experiment design

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果與分析

3.1.1 不同提取次數(shù)對銀杏內(nèi)酯提取率的影響

當選擇提取條件為料液比1：5，提取2 h，乙醇體積分數(shù)80%時，選取提取次數(shù)分別為 1～7 次，由圖3a可知增加提取次數(shù)有利于提取率的提高，當提取次數(shù)小于3次時提取率隨提取次數(shù)增加而增加，銀杏內(nèi)酯提取量增加；大于3 時，銀杏內(nèi)酯提取率趨于平穩(wěn)，表明銀杏葉中的內(nèi)酯接近提取完全，提取次數(shù)再多提取成本變大。

圖3 單因素試驗中不同條件對銀杏內(nèi)酯提取率的影響Fig.3 Impact of different conditions in single-factor experiment on extraction rate of ginkgolide

3.1.2 不同提取時間對銀杏內(nèi)酯提取率的影響

當選擇提取條件為料液比 1：5，提取 3 次，乙醇體積分數(shù)80%時，分別選擇提取時間0.5、1、1.5、2、2.5 h，由圖3b可知隨著提取時間的增加，提取愈發(fā)完全，溶液中銀杏內(nèi)酯含量增加，所以提取率增大。但在 2 h 之后，增加提取時間，提取率基本穩(wěn)定，為節(jié)約資源和時間，2 h最佳。

3.1.3 不同的乙醇體積分數(shù)對銀杏內(nèi)酯提取率的影響

當選擇提取條件為料液比 1：5，提取時間2 h，提取次數(shù)為 3 次，乙醇體積分數(shù)選擇0，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%時，由圖3c可知乙醇體積分數(shù)為40%時，銀杏內(nèi)酯的提取率最高。當乙醇體積分數(shù)大于40%時銀杏內(nèi)酯的提取率下降，這可能是由于提取溶液極性變化有關(guān)。

3.1.4 不同料液比對銀杏內(nèi)酯提取效果的影響

當選擇提取條件為提取 3 次，提取時間2 h時，在乙醇體積分數(shù)為80%的條件下，選取料液比為 1：5、1：10、1：15、1：20、1：25，由圖3d可知料液比(g/mL)大于 1：15時，乙醇溶液對銀杏內(nèi)酯提取效果不好，提取率較低。隨著料液比的減小，即溶劑量的增加，有利于銀杏內(nèi)酯的充分溶解，所以提取率增加。在料液比小于 1：15時，提取率趨于穩(wěn)定。

3.2 正交試驗結(jié)果

按L9(34)正交設(shè)計研究乙醇溶液加熱回流提取銀杏內(nèi)酯，以4種銀杏內(nèi)酯總量為指標，正交試驗結(jié)果見表4。

表4 銀杏內(nèi)酯提取工藝正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results of extraction technology of ginkgolides

通過表5方差分析可知，乙醇濃度和提取次數(shù)對銀杏內(nèi)酯含量有顯著影響，且影響程度乙醇體積分數(shù)大于提取次數(shù)，其影響順序為C>D>A>B，得出最佳提取工藝為A1B2C3D3，即提取時間1.5 h，料液比1：20，乙醇體積分數(shù)50%，提取次數(shù)3次時，銀杏內(nèi)酯提取率最高。

表5 銀杏內(nèi)酯正交提取試驗方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal extraction experiment of ginkgolides

3.3 驗證結(jié)果

為進一步驗證優(yōu)化工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份藥材各20 g,按上述最佳提取工藝即提取時間1.5 h，料液比1：20，乙醇濃度50%，提取次數(shù)3次進行驗證試驗，操作方法同前。結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯平均提取率為0.6786%，RSD為0.83%，表明此工藝穩(wěn)定可行。

4 結(jié)論

本試驗以銀杏葉為原料，通過正交試驗的方法確定最佳的提取工藝為提取時間1.5 h、料液比1：20、乙醇體積分數(shù)50%、提取次數(shù)3次。此方法可以用于指導(dǎo)實際生產(chǎn)，提高銀杏內(nèi)酯的提取率，減少生產(chǎn)成本。通過優(yōu)化銀杏內(nèi)酯的檢測方法，用異丙醇做流動相，可以減少雜質(zhì)對被測物質(zhì)的干擾，并提高被測物質(zhì)的分離度(R>7.2)，改善峰形，更加快速高效地測定提取物中銀杏內(nèi)酯的含量。試驗結(jié)果表明，本方法準確、可靠。

[1]陳西娟，王成章，葉建中.銀杏葉化學(xué)成分及其應(yīng)用研究進展[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2008,42(4):57-62.

[2]李金生，趙琪，郝勇.國內(nèi)銀杏葉化學(xué)成分及制備工藝的研究進展[J].白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006,4(4):220-222.

[3]KRAUS J. Water-soluble polysaccharides fromGinkgobilobaleaves [J]. Phytochemistry,1991, 30 (9): 3017-3020.

[4]van BEEK T A, SCHEEREN H A,RANTIO T,et al. Determination of ginkgolides and bilobalide inGinkgobilobaleaves and phytopharmaceuticals [J]. J Chromatogr,1991,543: 375-387.

[5]韓金玉，李海靜，褚巧偉等.天然藥物銀杏內(nèi)酯研究進展[J].化工進展，2000(2):23-25.

[6]盧定強，陳鈞.銀杏內(nèi)酯的藥理作用[J].江蘇理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2001,22(2):5-9.

[7]van BEEK T A. Ginkgolides and bilobalide: Theirphysica, chromatographic and spectroscopic properties [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2005,13(17):5001-5012.

[8]樓鳳昌，凌婭，唐于平,等.銀杏萜類內(nèi)酯的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國天然藥物，2004,2(1):11-15.

[9]呂幫玉，楊新河，毛清黎,等.銀杏葉黃酮提取與測定研究進展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,11(3):91-95.

[10]楊榮華，徐斌.銀杏葉中有效成分提取最優(yōu)化生產(chǎn)工藝研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2007,45(3):20-21.

[11]YANG C, XU Y R, YAO W X. Extraction of pharmaceutical components fromGinkgobilobaleaves using supercritical carbon dioxide [J]. J Agric Food Chem,2002,50(4):846-849.

[12]CHIU K L, CHENG Y C, CHEN J H,et al. Supercritical fluids extraction of Ginkgo ginkgolides and flavonoids [J].The Journal of Supercritical Fluids. 2002, 24(1):77-87.

[13]ZHU X Y, MANG Y L, XIE J,et al. Response surface optimization of mechanochemical-assisted extraction of flavonoids and terpenetrilactones from Ginkgo leaves [J].Industrial Crops and Products. 2011,34(1):1041-1052.

[14]黃敏珠，徐春玲，姚丹丹,等.銀杏葉片萜類內(nèi)酯含量測定方法改進[J].醫(yī)學(xué)導(dǎo)報，2010,29(3):377-378.

[15]LIANG X M, JIN Y, WANG Y P,et al. Qualitative and quantitative analysis in quality control of traditional Chinese medicines [J]. Journal of Chromatography A,2009,1216(11):2033-2044.

[16]SORA D I, STEFANESCU V, DAVID V,et al.Validation of an LC-MS/MS assay of terpenetrilactones in Ginkgo biloba extracts and pharmaceutical formulations through standard addition method [J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2009, 50(3): 459-468.

[17]REN P, ZHAO X L, ZHANG J，et al.Synthesis of high selectivity polymeric adsorbent andits application on the separation of ginkgo flavonol glycosides and terpene lactones[J].Reactive & Functional Polymers ，2008 ,68(4): 899-909.

Extraction technology of ginkgolides fromGinkgobilobaleaves

LI Wen-dong1,2, GAO Qian-shan2,YANG Peng3, YANG Bing-tian3,WANG Xiao2*

(1.School of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 3. Jinan Senkang Sanfeng Biological Engineering Co. LTD, Jinan 250014, China)

∶We determined optimum extraction condition ofGinkgobilobaleaves with the extraction rate of ginkgolides (ginkgo lactone, ginkgolides A, ginkgolide B and ginkgolide C) as an index. We employed orthogonal experiment to systematically investigate the impact of extraction time, solid-liquid ratio, ethanol concentration, and extraction time on extraction technology ofGinkgobilobaleaves. Ginkgolides content was determined through optimization of high performance liquid chromatography (HPLC-ELSD) and isopropanol of mobile phase. We also calculated extraction rate. Optimum extraction conditions are extraction time of 1.5 h, solid-liquid ratio of 1：20, ethanol concentration of 50% and extraction times of 3. This technology can improve extraction rate of ginkgolides, save testing cost, and is applicable to industrial production.

∶Ginkgobilobaleaves; ginkgolides; orthogonal experiment; extraction rate; isopropyl alcohol

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.005

2016-02-22

山東省科技發(fā)展計劃(2014GZX219003)

李文東(1990—)，男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者，王曉，男，研究員，研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。Email：wangx@sdas.org

R284.2; O656.3

A