徐 娟， 藍 英， 潘迎捷,2,3， 趙 勇,2,3， 張煒佳,2,3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

基于微流控技術的微生物細胞梯度稀釋分離方法

徐 娟1， 藍 英1， 潘迎捷1,2,3， 趙 勇1,2,3， 張煒佳1,2,3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

隨著微流控分析技術的快速發(fā)展，集成化的微流控芯片在滿足實驗高通量的同時，還在微生物細胞分離領域呈現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。本研究基于微流控技術，制備了以聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻片為材料的細菌細胞梯度稀釋分離芯片。該芯片的核心是通過一系列復雜的梯度網(wǎng)絡來實現(xiàn)對細菌懸液的連續(xù)稀釋，最終被分離的細菌細胞進入通道末端的存儲孔內。結果顯示，該方法能分離出的最少細菌細胞數(shù)低于10個。此芯片平臺操作簡單、耗時短、成本低，為微生物單細胞研究提供了新的途徑。

微流控芯片；微生物細胞分離；連續(xù)梯度稀釋

傳統(tǒng)微生物研究常以微生物群為分析對象，其所得到的群體平均信息往往掩蓋了微生物細胞之間的差異，導致實驗結果的偏差[1]。微生物單細胞分析(single-cell analysis)突破了以往診斷技術的瓶頸，可以研究微生物群中單個細胞獨特的功能和狀態(tài)，深入解析微生物細胞間的異質性、相互作用、信號傳導以及生理病理等運作機制[2]。從單個細胞入手闡明細菌的生長動態(tài)[3-5]、耐藥性[6-8]、趨化性[9]、運動行為[10]、群感效應[11]、被膜形成[12]以及進化[13]等生命活動的規(guī)律，成為現(xiàn)階段研究的熱點之一。以微機電加工發(fā)展起來的微流控技術，因集成度高、微型化、高通量等優(yōu)勢在微生物細胞分離研究領域顯示出極大的應用潛力[14]。目前，微流體細胞分離設備主要分為液滴式微流控和芯片式微流控兩大類。這兩種裝置有很大差異，但它們的共性是將微生物細胞分離到微升(μL)或納升(nL)級的反應室中，以此實現(xiàn)微生物細胞分離，同時降低實驗成本[15]。芯片式微流控具有與微生物細胞大小相匹配的通道尺寸(1～100 μm)，通過靈活的結構設計和精確的流路控制，在微生物細胞的定向操縱和微環(huán)境調控中呈現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[16]。Probst等[17]利用流體力學原理，在芯片入口注入氣泡，使通道中液流流經(jīng)氣泡時由原本的層流狀態(tài)變?yōu)閷α?。借助液流流向改變，成功將谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)截留在皮升級的微孔中，達到單個細菌接種的目的。通過凝膠包埋的方式，Choi等[18]將金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和腸球菌(Enterococci)固定在芯片瓊脂糖通道內，實現(xiàn)了細菌單細胞生長的實時觀察和藥敏檢測。液滴式微流控由傳統(tǒng)的單相微流控芯片技術發(fā)展而來，可以將微生物細胞封裝入液滴而不受外界條件的干擾，是良好的單細胞分離及反應設備[19-20]。Leung等[21]設計了一種編程式液滴芯片，該芯片由底部的蠕動泵和頂部的陣列液滴反應孔組成，每個微液滴包裹一個細菌細胞，單次實驗即可進行大規(guī)模細菌單細胞的培養(yǎng)。以上實驗多需要微通道內的流體模擬、灌注凝膠和制備液滴等，與之相比，微流控濃度梯度芯片可以利用多層次的分流匯流將樣品溶液快速稀釋，具有操作簡單、方便快捷等特點，為微生物細胞分離提供了新的方法[22]。徐艇[23]發(fā)明了一種微流控型人源細胞分離器，該裝置主要包括底座、斜面活動盤以及樹狀微流道。細胞懸浮液在斜面活動盤的樹狀微流道及重力作用下，實現(xiàn)分流分離。本研究根據(jù)上述連續(xù)梯度稀釋網(wǎng)絡的芯片設計及其在細胞分離研究中的應用，制備了一種針對細菌細胞分離的圣誕樹型微流控芯片，實現(xiàn)了細菌單細胞水平的分離。該芯片的核心是借助一系列復雜的梯度網(wǎng)絡來實現(xiàn)對細菌懸液的連續(xù)稀釋。此外，以更小尺寸的連接通道將主稀釋通道和細菌存儲孔相連的構型及入口角度的設計，使少量細菌細胞隨液流方向改變進入存儲孔中。實驗結果表明，該芯片性能良好，可對106數(shù)量的細菌細胞有效分流分離，為所需微生物細胞數(shù)目小或需從大量微生物細胞中分離出少量細胞的分析研究提供了新的角度，也拓展了微流控濃度梯度芯片在微生物細胞分離領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血性弧菌標準菌株VibrioparahaemolyticusATCC33847購自美國菌種保藏中心，于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 材料與試劑 多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline)購自上海生工生物工程有限公司；SU-8膠(SU-8 2025,美國MicroChem公司)、Sylgard 184硅橡膠彈性體和Sylgard 184固化劑(美國 Dow Corning公司)、單晶硅片(4英寸)購自上海蒙昌儀器有限公司。

1.1.3 主要儀器 URE-2000/35型光刻機(中科院光電技術研究所)；2XZ-2型真空泵(上?？崛鸨瞄y制造有限公司)；BPZ-6063LC型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；KW-4A型臺式勻膠機、BP-2B型烘膠、WH-1000等離子表面處理機、LSP01-1A型微量注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；Eppendorf 離心機( 5810R，美國 Eppendorf 公司)；Bio-Tek 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；EVOS?FL Auto全自動細胞成像系統(tǒng)(美國Life Technologies公司)； 美國 Milli-Q去離子水儀。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離芯片的設計和制作 選用經(jīng)典的“圣誕樹”型梯度稀釋微流控芯片分離細菌單細胞[24]。如圖1所示，芯片流體層結構主要由9級梯度形成網(wǎng)絡(Concentration Gradient Generator，CGG)和20個細菌存儲孔組成。流體層通道高20 μm，寬50 μm，梯度網(wǎng)絡的每個蛇形通道單元長5.776 mm，細菌存儲孔的截面為直徑96 μm的圓形結構。為減少流體通道中液流剪切力對存儲孔中細菌的損傷，并使細菌能夠固定在存儲孔中穩(wěn)定生長，存儲孔排列在流體通道的一側。存儲孔以尺寸更小的連接通道(上端23 μm，下端15 μm)與蛇形通道下端的垂直通道相連。連接通道入口設定一定角度，使少量細菌細胞隨液流方向改變進入存儲孔中。芯片采用標準軟光刻技術(soft-lithography)及模塑法制作[25]。

圖1 細菌細胞分離芯片設計圖Fig.1 Design of the bacteria cell separation chipA：梯度網(wǎng)絡蛇形通道的放大結構；b：細菌細胞存儲孔的放大結構A：Magnification of the serpentine channel of the gradient generator；b：Magnification of the bacteria cell storage well

1.2.2 細菌分離芯片的處理 將制備好的芯片于1×105Pa滅菌15 min，65 ℃烘干。使用前向芯片內灌注10 μg/mL的多聚賴氨酸溶液(Poly-L-lysine, PLL)對芯片進行包被，連續(xù)通入30 min后，將芯片放入培養(yǎng)皿內待用[26]。

1.2.3 芯片上的細菌細胞分離 取對數(shù)期生長的副溶血性弧菌(OD600=0.6)于10 mL離心管中，離心10 min (3 000 r/min，25 ℃)，去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，調整菌懸液的濃度使其終濃度為5×106cfu/mL。把細菌懸液和新鮮培養(yǎng)液分別加入1 mL注射器內，將注射器固定在注射泵上，以聚四氟乙烯管與芯片上相應入口相連。設置進樣速率為0.1 μL/min，進樣1 h。改變進樣速率，以低于接種速率10倍的流速在2個入口通入新鮮培養(yǎng)液，沖走通道中未黏附的細菌。其后，利用EVOS?FL Auto 顯微鏡的全自動成像系統(tǒng)，對細菌細胞分離結果進行觀察及拍攝。

2 結果與分析

2.1 細菌分離芯片的制作與表面處理

本研究制備的雙層結構細菌分離芯片由上層帶有流體通道的PDMS和下層適合細菌貼壁的玻片鍵合而成(圖2)。PDMS作為微流控技術中理想的使用材料之一，具有很多良好的特性，如熱穩(wěn)定性高、生物兼容性強、透氣透光性好，易于在顯微鏡下觀察等。盡管PDMS有諸多優(yōu)點，但未經(jīng)處理的芯片還不能直接用于細菌細胞的培養(yǎng)。實驗前應用75%的酒精多次沖洗芯片通道，以清除芯片加工過程中殘留的灰塵粒子等雜質；對芯片進行高壓滅菌處理，可保證芯片內沒有其他雜菌的污染。由于PDMS具有較強的疏水性，在向通道內輸送培養(yǎng)液時容易產生氣泡，對細菌造成損傷。為此，需采用合適的包被試劑，如明膠、 多聚賴氨酸、 纖連蛋白和膠原等使PDMS表面的親水性增加，以保持液體在通道內流動的順暢[27]。

圖2 細菌細胞分離芯片F(xiàn)ig.2 The photograph of bacteria cell separation chip

2.2 梯度稀釋網(wǎng)絡形成能力的驗證

在連續(xù)稀釋過程中，混合誤差由上一級到下一級逐級累加，因此充分混合是形成穩(wěn)定濃度梯度的前提條件。液體在微通道內的流動阻力是影響混合效果的主要因素。當所有微通道截面形狀相同時，流阻便取決于蛇形管道的總長度L。而增加2種溶液之間的接觸面可以提高分子擴散，因此通道長度越長，分子擴散越充分，混合效果越佳。此外，溶液流速小更利于混合[28]。根據(jù)以上理論分析，在本實驗中梯度網(wǎng)絡蛇形通道長度一定的情況下，則可通過調節(jié)進樣流速來控制濃度梯度的形成。

圖3a為用紅藍指示劑對芯片梯度網(wǎng)絡進行的定性表征。芯片的2個入口分別注入紅色指示劑和藍色指示劑，控制溶液流速為0.1 μL/min。在流體剪切力的作用和擴散效應下，2種溶液在蛇形通道內逐級分配、混合，最終在芯片末端的垂直通道各自形成不同的顏色。采用Color Cop軟件拾取每行的顏色，拾取顏色的順序為從左到右，記錄每行中顏色的RGB值，選取紅色分量(Red value)進行定量分析。從圖3b每行的線性梯度曲線可知，紅藍指示劑從梯度網(wǎng)絡的上一級到下一級均充分混合，最終可產生10個具有一定線性的不同濃度，直觀地表明該芯片能用于后續(xù)的細菌細胞分離實驗。

圖3 芯片梯度網(wǎng)絡形成能力的驗證Fig.3 Validation of the gradient networkA：梯度網(wǎng)絡的紅藍指示劑表征;b:以紅色分量值為指標的行2～行9的濃度梯度曲線A：Representation of the gradient network with red and blue dye;b:Concentration gradient curve based on red and blue value from line 2 to line 9

2.3 基于芯片的細菌細胞分離原理

該芯片平臺基于連續(xù)稀釋原理，即通過一系列連續(xù)簡單的稀釋以減少細菌濃度，使菌液在多層次通道網(wǎng)絡作用下實現(xiàn)分流分離。如圖4所示，芯片的2個入口同時通入新鮮培養(yǎng)液和細菌懸液，兩者在梯度網(wǎng)絡中逐級分流、匯流混合，如此循環(huán)反復，最終細菌細胞進入到皮升(pL)級的存儲孔中。此外，以更小尺寸的連接通道將主稀釋通道和細菌存儲孔相連的構型及入口角度的設計，使少量細菌細胞隨液流方向改變進入存儲孔中，以此達到分離的目的。

圖4 細菌細胞分離芯片F(xiàn)ig.4 The bacteria cell separation chip

a:細菌細胞分離芯片，結構a1、a2分別對應圖b、圖c;b:芯片2個入口同時通入培養(yǎng)液和細菌懸液，在連續(xù)稀釋的作用下形成圖c所示的細菌細胞分離效果

a：Schematic drawing of the chip channel geometry；b：Medium and bacteria cells were loaded from the two inlets，With the performance of gradient network, bacteria cells were separated by continuous dilution which showed in c

2.4 芯片上的細菌細胞分離

芯片通道內空間狹窄，細菌接種前應將菌液充分振蕩，以免細菌細胞成團堵塞通道或在芯片內分布不均。選擇低進樣流速，易于細菌細胞在存儲孔內停留并貼壁。由圖5可見，細菌細胞在芯片內部均勻鋪展，少有抱團?？?～孔5中，細菌細胞以隨機分布的形式在存儲孔中單層呈現(xiàn)。由于通道的高(20 μm)與細菌細胞的大小(2～3 μm)不在同一尺度，當孔內細菌細胞逐漸增多時，細菌細胞在有限的存儲空間會出現(xiàn)上下重疊的現(xiàn)象。故選取孔1～孔8作為分析對象。如圖6所示，該芯片平臺能夠分離出的最少細菌細胞數(shù)低于10個，成功實現(xiàn)了細菌細胞的分流分離。然而，該方法僅是依賴于通道結構的簡單分離，只針對某一類微生物細胞，不能對大小形狀相似的不同種細胞進行精確分離。因此，采用更精密的加工技術，優(yōu)化通道設計是下一步的研究方向。

圖5 細菌細胞分離結果顯微觀察圖Fig.5 Phase contrast fields at 40× magnification of bacteria cell well

圖6 8個存儲孔內細菌細胞數(shù)分析Fig.6 Bacterial cell number analysis in eight storage wells

3 討 論

基于微流控芯片技術，本研究設計并制作了一種微生物細胞分離芯片。該芯片借助一系列梯度網(wǎng)絡實現(xiàn)對細菌懸液的連續(xù)稀釋，可對106數(shù)量的細菌進行有效分離，且能分離出的最少細菌細胞數(shù)低于10個。該方法操作簡單、分離時間短、節(jié)約試劑、避開了熒光標記和復雜精細的檢測系統(tǒng)，為微生物單細胞研究提供了新的技術手段。此外，該芯片平臺還可以用來進一步探索微生物單細胞水平上的生長行為、運動特性以及藥物刺激等研究，具有一定的應用前景。

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A Microfluidic Gradient-Dilution Chip for Rapid Microbe Cell Separation

XU Juan1, LAN Ying1, PAN Ying-jie1, 2, 3, ZHAO Yong1, 2, 3, ZHANG Wei-jia1, 2, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306; 2.ShanghaiEngin.Res.Ctr.ofAqua-Prod.Process. &Preserv'n,Shanghai201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm'tforAqua-Prod.onStor. &Preserv'n(Shanghai),Minist.ofAgric.Shanghai201306)

Along with the rapid advances in microfluidic technology, the integrated microfluidic chip has the potential to meet the demand of high-throughput experimentations in lab and especially presents the special superiority in the field of microbe cells separation. Based on the microfluidic technology, a polydimethoxysilane (PDMS)-glass microchip was prepared in this study which contains a network of gradient-forming channels for bacteria cells separation. The core of the microchip is to realize a successive dilution process by means of a series of complicated gradient network and finally the isolated bacteria cells entered to the end of the channel. The results showed that the number of separated bacteria cells by this method could be separated at minimum of less than ten. This chip platform is simple to operate, short time consuming, and low cost, which provide a new pathway to study microbe single-cell.

microfluidic chip; microbe cells separation; successive gradient dilution

國家自然科學基金項目(31501555)；上海市科委項目(14DZ1205100,14320502100)；浦江人才計劃項目(14PJ1404300)；

徐娟 女，碩士研究生。研究方向為微流控微生物分析芯片。E-mail: yuansuwawaxj@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士。研究方向為微流控生物化學分析芯片。E-mail: wj-zhang@shou.edu.cn

2015-11-25；

2015-12-04

Q-31

B

1005-7021(2016)05-0097-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.017

上海市科技興農重點攻關項目(滬農科攻字2015第4-8號)